Карина каримова в контакте 3 августа: Страница не найдена - МГПУ

Содержание

О проекте. Человек и закон. Первый канал

Основное правило программы старо как мир: информация из первых рук и только проверенные факты.

Общественно-политическая программа «Человек и закон» выходит на Первом канале уже 35 лет (Алексей Пиманов ведет программу с 1996 года). Столь «преклонный возраст» ничуть не мешает программе оставаться одной из самых востребованных и актуальных на отечественном телевидении. Быть может потому, что основные темы — борьба с организованной преступностью, расследования о коррупции в высших эшелонах власти, криминальные истории…

Программа старается дать взвешенную оценку важнейшим событиям в политической, экономической и социальной жизни страны, освещает огромный спектр вопросов и проблем, с которыми каждодневно приходится сталкиваться человеку, причем не только с правовой точки зрения, но и с позиций общечеловеческой нравственности (заметим в скобках, что речь идет не о навязшем в зубах «шаманском моралите» советских времен или вызывающем оскомину «демагогическом словоблудии», а прежде всего об основополагающих ценностях человеческого общежития, которых осталось не так уж и много в современном мире). Именно поэтому «Человек и закон», ориентируясь на рядового зрителя, постоянно следит за судьбой своего постоянного героя — обыкновенного человека, попавшего в клещи несправедливости и беззакония.

Алексей Пиманов любит приглашать в студию программы «Человек и закон» гостей. Это основные ньюсмейкеры недели — политики, представители силовых структур и правоохранительных органов, известные журналисты со своими не всегда «удобными» расследованиями, известные всей стране VIP-персоны, не по своей вине попавшие в крупную передрягу (будь то неправильно оформленные авторские права, защита чести и достоинства или спровоцированное ДТП).

Связаться с редакцией можно по почте: [email protected]; [email protected] или по телефону: +7495 617-91-92. Также вы можете обратиться к юристам и адвокатам правового центра передачи «Человек и закон» по телефону +7495 646-06-97 или по электронной почте [email protected].

ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ПЕРВОКУРСНИКОВ ПО ЗАСЕЛЕНИЮ В ОБЩЕЖИТИЯ! / Главные новости

Авг 27, 2020

Уважаемые студенты Южно-Уральского технологического университета и Уральского регионального колледжа, заселение в общежития организовано по графику.

Общежитие по адресу: Володарского, 12. Заселение 31 августа с 10:00 до 13:00

Комендант – Надежда Дмитриевна
Необходимо для заселения: Цветная фотография 3*4, паспорт студента и законного представителя (копия + оригинал при себе)

*При заселении выдают матрас, подушку, одеяло (при желании — привезти свои вещи для спального места)
ЗАПРЕЩЕНО: животные, нагревательные бытовые электроприборы (печки, мультиварки, чайники)

Список обучающихся ОУ ВО «Южно-Уральский технологический университет», ПОУ «Уральский региональный колледж» к заселению в общежитие на Володарского, 12:

ФИО	Учебное заведение	Группа/направление
Локтионов Всеволод Вадимович	УРК	40. 02.01
Мусахаджиев Мовлид Мовладиевич	УРК	40.02.02
Мусахаджиев Умалт Мовладиевич	УРК	09.02.03
Лопатин Илья Васильевич	УРК	33.02.01

Колегло Ксения Александровна	УРК	40.02.02
Кузнецова Екатерина Дмитриевна	УРК	40. 02.02
Ложкина Полина Антоновна	УРК	40.02.02
Лукина Яна Евгеньевна	УРК	40.02.02

Смирных Арина Никитична	ЮУТУ	ТД-106
Михайлова Ярослава Михайловна	ЮУТУ	ТД-106
Попок Виктория Юрьевна	ЮУТУ	ТД-106
Рожок Дарья Сергеевна	ЮУТУ	ТД-106

Иванюк Алёна Олеговна	УРК	33. 02.01
Карелина Алёна Вадимовна	УРК	34.02.01
Каримова Карина Равильевна	УРК	34.02.01
Москвичева Екатерина Сергеевна	ЮУТУ	ГМУ-102

Зяблова Диана Денисовна	УРК	34.02.01
Ишмухаметова Сара Куанышевна	УРК	34. 02.01
Упакова Венера Альфритовна	УРК	34.02.01
Паршина Надежда Александровна	УРК	право и суд.

Истамгулова Элиза Мансуровна	УРК	40.02.02
Калиниченко Анастасия Анатольевна	УРК	40.02.02
Клевцова Анастасия Владиславовна	УРК	40. 02.02

Мамаджанова Мунис Юлдашевна	УРК	40.02.03
Мингазова Аэлита Ренатовна	УРК	40.02.02
Мочалова Владена Николаевна	УРК	40.02.02

Общежитие по адресу: Образцова, 4. Заселение 31 августа с 08:30 до 16:00

Комендант – Елена Александровна
Необходимо для заселения: Совершеннолетний обучающийся может оформить договор проживания самостоятельно на себя, для этого необходимо иметь при себе личный паспорт + копию.

Несовершеннолетний обучающийся приезжает с родителем (законным представителем), необходим паспорт родителя и паспорт студента + копии.

*При заселении выдают матрас, подушку, одеяло (при желании — привезти свои вещи для спального места)
ЗАПРЕЩЕНО: животные.

Список обучающихся ОУ ВО «Южно-Уральский технологический университет», ПОУ «Уральский региональный колледж» к заселению в общежитие на Образцова, 4:

ФИО	Учебное заведение	Группа/направление
Аскаров Радик Рамилевич	ЮУТУ	ЭБ-108
Богданов Дмитрий Федорович	УРК	33. 02.01
Богодух Данил Олегович	УРК	09.02.03
Бугилин Александр Евгеньевич	УРК	38.02.03
Бухтояров Илья Сергеевич	ЮУТУ	И-107
Воронин Егор Дмитриевич	ЮУТУ	С-116
Гиниятуллин Руслан Ильясович	УРК	34.02.01
Гусейнов Тунар Техран Оглы	ЮУТУ	ТД-106
Детина Николай Константинович	УРК	40. 02.01
Есимов Руслан Бореевич	ЮУТУ	ГМУ-102
Желнин Дмитрий Павлович	ЮУТУ	ГМУ-102
Заикин Анатолий Владимирович	ЮУТУ	С-116
Захаров Илья Евгеньевич	УРК	40.02.02
Зацепилин Илья Павлович	УРК	40.02.02
Зубенин Вадим Андреевич	ЮУТУ	ТД-106
Исламов Динис Ринатович	УРК	40. 02.02
Иштимиров Руслан Вадимович	УРК	40.02.02
Казанцев Никита Евгеньевич	ЮУТУ	ТД-106
Кобелев Александр Николаевич	УРК	38.02.07
Контеров Станислав Станиславович	УРК	40.02.02
Кужин Аслан Серикович	УРК	40.02.03
Лаптев Егор Владимирович	ЮУТУ	И-107
Луковецкий Дмитрий Алексеевич	УРК	40. 02.02
Мирзобоев Мирзорустам Бахтиёрович	ЮУТУ	С-116
Михайлов Илья Александрович	ЮУТУ	С-116
Обухов Кирилл Евгеньевич	УРК	40.02.02
Пашнин Дмитрий Владимирович	УРК	40.02.02
Перцев Иван Валерьевич	ЮУТУ	Ю-101
Петухов Вячеслав Сергеевич	ЮУТУ	ЭБ-108
Пикунов Кирилл Сергеевич	ЮУТУ	А-110
Рахметов Рустем Бауржанович	ЮУТУ	Ю-101
Редреев Никита Андреевич	УРК	38. 02.03
Резепин Вадим Олегович	ЮУТУ	И-107
Репников Вячеслав Денисович	УРК	09.02.03
Суханов Семен Евгеньевич	УРК	09.02.03
Фетисов Дмитрий Александрович	ЮУТУ	ЭБ-108
Шамин Альберт Антонович	ЮУТУ	ТД-106
Шапкин Ярослав Андреевич	УРК	40. 02.02
Шеметов Николай Сергеевич	УРК	40.02.02
Щербинина Ирина Константиновна	ЮУТУ	ГМУ-102
Юлдошев Шукрулло Муллошарофович	УРК	40.02.02

Общежитие по адресу: Шоссе Металлургов, 47. Заселение 30-31 августа с 09:00 до 16:00

Комендант – Дамира Сабировна
Необходимо для заселения: Совершеннолетний обучающийся может оформить договор проживания на себя, для этого необходимо взять с собой: паспорт, копия паспорта, цветное фото 3*4 (1 шт.), файл А4. Несовершеннолетний обучающийся должен взять с собой: копия паспорта родителя (законного представителя), свой личный паспорт, копия личного паспорта, цветное фото 3*4 (1 шт. ), файл А4.

*При заселении выдают матрас, подушку, одеяло (при желании — привезти свои вещи для спального места)
ЗАПРЕЩЕНО: животные, эл.плитки.

Список обучающихся ОУ ВО «Южно-Уральский технологический университет», ПОУ «Уральский региональный колледж» к заселению в общежитие на Шоссе Металлургов, 47:

ФИО	Учебное заведение	Группа/направление

Абдрахманова Милена Олеговна	УРК	33.02.01
Абишева Карина Темирбековна	УРК	34. 02.01
Азаркина Марина Алексеевна	УРК	21.02.05
Акимова Александра Валерьевна	УРК	40.02.02
Аношкина Екатерина Вячеславовна	УРК	40.02.01
Асватова Виктория Рамилевна	УРК	40.02.03
Асельборн Алена Валерьевна	УРК	21.02.05
Аскадуллина Алия Олеговна	УРК	40. 02.02
Балакина Ульяна Игоревна	УРК	34.02.01
Бардакова Анна Владимировна	УРК	40.02.02
Баширова Светлана Рауфовна	УРК	40.02.02
Безельт Ольга Андреевна	УРК	40.02.01
Белкина Екатерина Александровна	УРК	40.02.02
Бигильдина Оксана Рафаиловна	УРК	21. 02.05
Бобоева Милана Шавкатовна	УРК	34.02.01
Бойко Елена Юрьевна	УРК	34.02.01
Борисова Софья Андреевна	УРК	40.02.02
Бревенникова Ксения Анатольевна	УРК	40.02.02
Бюлер Александра Владимировна	УРК	40.02.02
Габдрахманова Алина Раисовна	УРК	33. 02.01
Ганиева Карина Фанисовна	УРК	38.02.03
Гинц Олеся Руслановна	УРК	21.02.05
Глебова Виктория Викторовна	УРК	40.02.02
Голубева Злата Олеговна	УРК	33.02.01
Горлова Дарья Владимировна	УРК	40.02.02
Гракова Ксения Сергеевна	УРК	33.02.01
Гребенкина Анастасия Андреевна	УРК	40.02.02
Гридина Юлия Константиновна	УРК	34.02.01
Гусева Софья Сергеевна	УРК	40.02.02
Джакупова Сабрина Сериковна	УРК	33.02.01
Дойкина Дарья Васильевна	УРК	33.02.01
Долгих Наталья Владимировна	УРК	40.02.02
Долгодворова Арина Андреевна	УРК	40.02.02
Долженко Юлия Дмитриевна	УРК	38.02.03
Драцкая Ксения Дмитриевна	УРК	33.02.01
Желонкина Ольга Сергеевна	УРК	54.02.01
Зубаерова Рушания Ренатовна	УРК	33.02.01
Зырянова Анастасия Валерьевна	УРК	40.02.02
Иванова Татьяна Михайловна	УРК	33.02.01
Измайлова Анна Александровна	УРК	54.02.01
Каримова Карина Равильевна	УРК	34.02.01
Клюшенкова Анна Димитревна	УРК	33.02.01
Коврина Анастасия Вячеславовна	УРК	33.02.01
Кошкина Инна Дмитриевна	УРК	38.02.01
Крутова Юлия	УРК	40.02.02
Крысина Екатерина Сергеевна	УРК	54.02.01
Курова Ксения Владимировна	УРК	09.02.03
Левушкина Ангелина (КЗ) — позднее	УРК	203
Лизогуб Дарья Вячеславовна	УРК	38.02.03
Лученкова Злата Игоревна	УРК	38.02.03
Мурзакамалова Василя Аскатовна	УРК	40.02.02
Муртазина Лилия Азатовна	УРК	33.02.01
Мысляева Карина Александровна	УРК	40.02.02
Плешкова Алёна Михайловна	УРК	34.02.01
Погодина Кристина Васильевна	УРК	40.02.02
Пологова Наталья Анатольевна	УРК	33.02.01
Попыловская Ирина Антоновна	УРК	40.02.02
Потапова Кристина	УРК	П-248
Пряхина Екатерина Александровна	УРК	40.02.02
Ревенко Светлана Владимировна	УРК	38.02.01
Решетникова Марина Николаевна	УРК	21.02.05
Сафаргалина Регина Фуатовна	УРК	40.02.02
Сизинцева Мария Андреевна	УРК	40.02.01
Сиражитдинова Алия Рифатовна	УРК	33.02.01
Скворцова Анастасия Андреевна	УРК	40.02.02
Скоморохова Варвара Владимировна	УРК	33.02.01
Смагина Алёна Олеговна	УРК	54.02.01
Смышляева Кристина Юрьевна	УРК	54.02.01
Соколова Дарья Александровна	УРК	40.02.02
Субота Дарья Александровна	УРК	Экономика и бу
Суховерхова Анастасия Александровна	УРК	40.02.02
Тихонова Виктория Александровна	УРК	40.02.02
Топычканова Анастасия Александровна	УРК	38.02.03
Трофимова Мария Витальевна	УРК	40.02.02
Фадюшина Анна Андреевна	УРК	33.02.01
Фатыхова Ксения Руслановна	УРК	54.02.01
Фомина Елизавета Денисовна	УРК	54.02.01
Хоменко Елена Михайловна	УРК	21.02.05
Ческидова Юлия Дмитриевна	УРК	40.02.02
Чиркина Арина Вячеславовна	УРК	33.02.01
Шайхитдинова Диана Вадимовна	УРК	33.02.01
Шугурова Регина Фуатовна	УРК	40.02.02
Якимова Полина Александровна	УРК	34.02.01
Ярушина Марина	УРК	Зн-314а

Алимов Руслан Фатякович	УРК	34.02.01
Маточник Данил	УРК	П-210
Орехов Никита Дмитриевич	УРК	40.02.02
Стрижов Вадим Васильевич	УРК	40.02.02
Пашнин Дмитрий	УРК
Дмитриев Илья	УРК

Общежитие по адресу: Энгельса, 83. Заселение 31 августа с 9 до 16:00

Комендант – Татьяна Павловна
Необходимо для заселения: Копия паспорта (главная страница, прописка), Копия ФОГ (флюорография), Мед. Справка форма 086у (копия), 4 фото 3х4, Копия ИНН.

ЗАПРЕЩЕНО: животные

Список обучающихся ОУ ВО «Южно-Уральский технологический университет», ПОУ «Уральский региональный колледж» к заселению в общежитие на Энгельса, 83:

Агзамова Регина Ринатовна	ЮУТУ	А-110
Агибалова Виктория Ивановна	ЮУТУ	ЭБ-108
Аксёнова Анастасия Сергеевна	ЮУТУ	Д-105
Бархатова Дарья Юрьевна	ЮУТУ	ЭБ-108
Варганова Алёна Андреевна	ЮУТУ	Ю-101
Вернер Полина Александровна	ЮУТУ	А-110
Вершинина Анастасия Викторовна	ЮУТУ	А-110
Волокитина Екатерина Вадимовна	ЮУТУ	М-103
Гусева Софья Сергеевна	ЮУТУ	М-103
Дюрягина Елизавета Владимировна	ЮУТУ	ТД-106
Дядик Дарья Дмитриевна	ЮУТУ	М-103
Жаворонкина Ксения Петровна	ЮУТУ	А-110
Жамалетдинова Русалина Ринатовна	ЮУТУ	ТД-106
Зверева Анастасия Владимировна	ЮУТУ	Ю-101
Каримова Элен Тимуровна	ЮУТУ	ТД-106
Карнаухова Юлия Сергеевна	ЮУТУ	Д-105
Коваль Дарья Евгеньевна	ЮУТУ	А-110
Кокорева Марина Валерьевна	ЮУТУ	ТД-106
Кушкарова Аделина Нагашбаевна	ЮУТУ	Ю-101
Литвинова Софья Андреевна	ЮУТУ	Д-105
Марина Вера Сергеевна	ЮУТУ	Ю-101
Миргородская Алёна Юрьевна	ЮУТУ	И-107
Михно Александра Дмитриевна	ЮУТУ	Ю-101
Симинович Елизавета Вячеславовна	ЮУТУ	Ю-101
Слесарева Екатерина Владимировна	ЮУТУ	Ю-101
Смакова Виктория Андреевна	ЮУТУ	Ю-101
Султанова Юлиана Денисовна	ЮУТУ	ГМУ-102
Топоркова Ксения Вячеславовна	ЮУТУ	Ю-101
Уфимцева Алина Александровна	ЮУТУ	Ю-101
Феденева Диана Алексеевна	ЮУТУ	Ю-101
Хажиева Валерия Айдаровна	ЮУТУ	С-116
Шаимова Карина Руслановна	ЮУТУ	И-107
Шильд Алёна Алексеевна	ЮУТУ	ГМУ-102
Шайхитдинова Лиана Барадатовна	ЮУТУ	ГМУ-102
Савченко Федор Андреевич	ЮУТУ	И-107
Корякин Антон Андреевич	ЮУТУ	Ю-101

Уважаемые студенты, если у вас изменились потребности в общежитии,
просьба сообщить куратору общежитий ЮУТУ, также по всем возникающим вопросам:
Надежда Александровна (https://vk.com/id65075872 , тел. +7 (351) 731-01-12)

Внимание! Вход в общежитие в маске !

Акции Twitter упали на 10%. Бизнесу соцсети угрожает новая политика Apple :: Новости :: РБК Инвестиции

Бумаги снижаются через день после выхода отчетности, так как инвесторы опасаются будущего влияния на бизнес новой политики конфиденциальности. Ведущие инвестдома понизили прогнозы по акциям соцсети

Фото: Shutterstock

Акции Twitter падают на торгах в среду на 9,47%, до $55,61 на 21:27 мск, на следующий день после выхода отчетности, результаты которой не в полной мере оправдали ожидания аналитиков.

В день публикации данных бумаги сервиса микроблогов росли на 1,6%. Однако сегодняшнее снижение говорит о том, что компании не удалось развеять опасения инвесторов по поводу потенциального негативного влияния на Twitter изменений в политике конфиденциальности Apple, отмечает Bloomberg.

Накануне компания сообщила о выручке за третий квартал в размере $1,28 млрд, что на 0,31% ниже прогнозов аналитиков, скорректированная прибыль на акцию составила $0,18 при прогнозе в $0,15. Количество ежедневных монетизируемых активных пользователей сервиса достигло 211 млн, в то время как аналитики ожидали 211,9 млн.

После публикации отчетности Twitter аналитики понизили целевые цены акций сервиса, что стало еще одной причиной обвала котировок:

JPMorgan Chase с $90 до $86 с рейтингом «выше рынка»;
Wedbush с $76 до $69 с рейтингом «нейтрально»;
MKM Partners с $83 до $77 с рейтингом «покупать»;
BMO Capital Markets с $70 до $65 с рейтингом «на уровне рынка»;
Jefferies с $80 до $70 с рейтингом «держать»;
KeyCorp с $81 до $70 с рейтингом «выше рынка»;
Canaccord Genuity с $78 до $72 с рейтингом «держать».

Согласно заявлению Twitter, влияние изменений в политике конфиденциальности Apple оказалось менее значительным, чем ожидалось, и будет слабо влиять на бизнес в четвертом квартале. Ранее компании Snap и Facebook назвали эти обновления со стороны Apple основной проблемой для их бизнеса в предыдущем квартале. По состоянию на 21:39 мск бумаги Snap и Facebook падают на 5,75% и 0,19% соответственно.

Фото: Shutterstock

Согласно новым правилам, пользователей приложений во всплывающем окне будут спрашивать, хотят ли они, чтобы их действия отслеживали. Противники нововведения считают, что теперь будет сложнее отслеживать эффективность цифровой рекламы.

Акции Twitter дешевеют шестой день подряд, что является самым продолжительным падением с августа. Бумаги снижались на 8,3% после публикации отчетности Snap, глава которой сообщил, что рекламный бизнес компании «был дезорганизован» из-за изменений в правилах конфиденциальности Apple.

Аналитики понизили цели по акциям Facebook. Но потенциал роста еще велик

Аналитики отмечали, что Twitter менее подвержена влиянию изменений в политике конфиденциальности Apple, чем некоторые более зависящие от рекламы конкуренты, так как Twitter больше ориентируется на рекламу бренда, а не на рекламу прямого отклика, которая важна для других игроков этого сегмента.

Котировки акций Twitter отражают основные опасения, что на рост и/или прогноз показателей бизнеса окажут влияние изменения в системе конфиденциальности Apple и проблемы с цепочками поставок, считает аналитик Baird Колин Себастьян.

Эксперт Jefferies Брент Тилл предполагает, что на бумагах сказывается разочарование инвесторов по поводу количества пользователей сервиса в США, которое за квартал почти не изменилось. А это, в свою очередь, может говорить о перенасыщении сервисом рынка страны.

Больше новостей об инвестициях вы найдете в нашем телеграм-канале «Сам ты инвестор!»

Автор

Карина Каримова

«Царицыно» приглашает на «Ночь в музее» / Музей-заповедник «Царицыно»

15 мая в ГМЗ «Царицыно» пройдут сразу две акции – «Ночь в музее» и «Дни исторического и культурного наследия». В течение всего дня посещение музейных экспозиций будет бесплатным, а по всей территории музея будут проходить различные мероприятия: бесплатные экскурсии и концерты, которые смогут посетить все желающие. Также в этот день пройдет чемпионат по мини-футболу. Для входа в музей обязателен бесплатный билет, приобретенный на портале mos.ru. Помимо офлайн-программы, мы приготовили для вас несколько трансляций онлайн, подробности о которых представлены по ссылке (или ниже в этой же публикации).

Страница покупки билетов размещена по ссылке.

Представляем вам программу событий.

11:00, 13:00. Экскурсия «Цветущие сады Царицыно»

Царицыно – это место, в котором соединены целые эпохи от седой древности до наших дней: грандиозный и причудливый архитектурный ансамбль XVIII века, обширные пруды, храм иконы Божией Матери «Живоносный Источник» и парк с великолепными видами и пейзажами.

Приглашаем вас прогуляться по аллеям Воздушных садов усадьбы Царицыно, полюбоваться декоративными и плодовыми растениями, посетить Сиреневый сад усадьбы. Сирень – один из самых любимых и распространенных в нашей стране декоративных кустарников, а в XIX веке она была символом дворянской усадьбы. Сирень росла в усадьбах «Мураново» Тютчева, «Шахматово» Блока, «Домотканово» Серова. Царицыно – не исключение; в разные годы здесь выращивали «сирень английскую, красную, белую, сибирскую». В ходе экскурсии вы узнаете, что росло в Воздушных садах, почему Царицыно стало престижной дачной местностью и как жили царицынские дачники. Продолжительность – 45 минут.

Участие – по регистрации:
Экскурсия в 11:00
Экскурсия в 13:00

14:00. Экскурсия с бегущим искусствоведом

В «Ночь в музее» Музей-заповедник «Царицыно» приглашает принять участие в уникальной беговой экскурсии по территории Царицынского парка. Экскурсию проведут «бегущий искусствовед» Анна Карганова – координатор IV Триеннале текстильного искусства и современного гобелена, которое начнется в музее-заповеднике «Царицыно» в июле 2021 года, и автор пешеходных и беговых маршрутов по Царицыну Ольга Пугач. Участники экскурсии узнают о Царицыне, а также об арт-объектах, которые появятся в парке во время триеннале.

Длина трассы забега – 6 км. Темп передвижения будет комфортным.
Участие в экскурсии бесплатное, по регистрации.

Пожалуйста, приходите в спортивной, желательно беговой, обуви и одежде!

Современные художники и мастера гобелена создадут 16 работ специально к триеннале и разместят их на территории парка. Участники экскурсии узнают об этих объектах, о том, что вдохновляет художников, а на финише сыграют в творческую игру на призы от музея-заповедника «Царицыно» и районного центра «Эльбрус».

Старт – в 14:00 от м. Орехово (КПП 8), финиш – в 15:30-16:00 в «Эльбрусе».

19:00. Атриум Хлебного дома. Презентация книги Екатерины Марголис «Венеция. Карантинные хроники».

В «Ночь в музее» в музее-заповеднике «Царицыно» пройдет презентация книги Екатерины Марголис, в основу которой легли заметки и акварели автора, созданные карантинной весной 2020 года. В результате получился художественный дневник, запечатлевший изменения, происходящие с человеком и с городом во время пандемии, обрушившейся на весь мир и в том числе – на Венецию.

Вход на событие – бесплатный, по регистрации.

Екатерина Марголис родилась в Москве. Изучала лингвистику и семиотику в РГГУ, стажировалась в университетах Падуи и Мельбурна. Около 20 лет живёт в Венеции, где преподаёт в Международной школе графики (Scuola Internazionale di Grafica). Екатерина – автор статей и эссе о литературе и культуре, член Европейского совета искусств. В 2015 году её книга «Следы на воде» получила премию НОС в номинации «Приз читательских симпатий».

До 29 августа в Хлебном доме в «Царицыне» работает выставка «Под маской Венеции» – большой международный проект, созданный в партнёрстве с Открытым фестивалем искусств «Черешневый лес» и Фондом городских музеев Венеции. Выставка посвящена венецианской культуре XVIII века – времени, с которым связаны знаменитый Венецианский карнавал, живопись, театр и литература эпохи Просвещения. Выставка наглядно демонстрирует удивительную связь России и Венецианской республики XVIII столетия.

19:00, Екатерининский зал. Музыкальная программа Patterns
21:00, Таврический зал. Музыкальная программа Memories

Музыкальную программу «Ночи в музее» курирует Глеб Андрианов — композитор, мультиинструменталист, создатель лаборатории современной музыки в культурном центре ЗИЛ, художественный руководитель Московского оркестра импровизационной музыки, концертный директор лейбла Leveldva.Гостей музея ждет музыкальное путешествие в мир спонтанных композиций и концерт пространственной музыки в исполнении струнного оркестра лаборатории Глеба Андрианова. Дополнит программу пластический перформанс Юлии Рогозинской и Брайана Опоку. Основное действие случится в Екатерининском и Таврическом залах.

Увидеть программу может любой посетитель музея, который возьмет билет на указанное время.

Главная идея «пространственной музыки» состоит в том, что расположение и движение источников звука является основным параметром композиции и центральным признаком восприятия. Это может быть один мобильный источник или несколько одновременных стационарных или мобильных звуковых событий в разных местах.

Участники музыкальной лаборатории: Глеб Андрианов (рояль, электроника), Алина Петрова (альт, электроника), Олег Маряхин (саксофоны), Павел Гришин (альт), Карина Каримова (скрипка), Дмитрий Резвов (виолончель), София Хоменко (флейта), Елена Федоренко (флейта), Нианила Комарова (скрипка), Константин Бюрно (виолончель), Екатерина Животова (скрипка), Данил Епифановский (скрипка), Андрей Педанов (скрипка), Ольга Заяц (скрипка), Артем Кушлевич (альт), Арина Комарова (альт). Пластический перформанс: Брайан Опоку, Юлия Рогозинская.

21:00, 22:30 Экскурсии «Ночное Царицыно»

С наступлением сумерек уникальные архитектурные памятники Царицына освещаются множеством огней и представляют редкое по красоте зрелище, которое заставляет восхититься блистательной красотой отреставрированных и заново воссозданных архитектурных шедевров Василия Баженова и Матвея Казакова. Гостей ждет неспешная прогулка по усадьбе с рассказом об истории строительства императорской резиденции, о драматичной судьбе уникального архитектурного ансамбля, строения которого похожи на музей безудержных затей XVIII века, богатого на выдумки, фантазии и капризы. Участники экскурсии познакомятся с тем, что получило название «театр архитектуры» Баженова, и услышат интригующий рассказ о событиях, некогда случившихся здесь, связанных с именами Екатерины II и Потемкина. Продолжительность – 45 минут.

Участие – по регистрации:
Экскурсия в 21:00
Экскурсия в 22:30

10:00 — 14:00. Финал турнира по мини-футболу

Если вы любите поболеть на спортивных матчах – в этот день на футбольном поле между КПП №3 и КПП №4 с 10:00 до 14:00 пройдет финал турнира Департамента культуры города Москвы по мини-футболу на кубок ГМЗ «Царицыно». За звание лучшей будут соревноваться команды парка «Зарядье», театра Et Cetera, ФК «Мосгортур», «Москино», «Инкоцентр».

Онлайн-программа

Если у вас не будет возможности посетить музей лично — предлагаем вам посмотреть наши трансляции и YouTube-выпуски.

В 19:00 пройдет прямая трансляция награждения победителей культурной акции «Весенний марафон», который проводился на сайте «Активный гражданин» с 6 апреля по 10 мая.

Сразу после награждения начнется концерт Patterns струнного оркестра лаборатории Глеба Андрианова. Дополнит программу пластический перформанс Юлии Рогозинской и Брайана Опоку.

Посмотреть трансляцию концерта можно на YouTube-канале музея, а также на наших страницах в социальных сетях Вконтакте и Одноклассники.

Также к акции «Ночь в музее» на нашем YouTube-канале мы подготовили специальный плейлист, который решили посвятить парку. В него мы включили обзорную экскурсию по территории музея-заповедника, экскурсию по местам царицынских дачников XIX века и прогулки по двум историческим маршрутам – Утренней и Береговой дорожкам. А чтобы подготовить вас к встрече с царицынской природой, мы добавили в плейлист серию интервью с учеными-биологами о царицынских белках, утках, огарях, цветах, насекомых и даже водорослях.

Плейлист размещен по ссылке.

Добро пожаловать в «Царицыно»!

Карина Цуркан показала «логово шпионки»

В суд женщина собирается с вещами — она почти не сомневается, что ее отправят обратно в «Лефортово». А то время, что она провела на свободе, называет своего рода сбоем в системе.

Справка «МК»: «По версии следствия, топ-менеджер «Интер РАО» Карина Цуркан была в 2004 году завербована молдавскими спецслужбами. В период с августа по сентябрь 2015 года она вроде как трижды передавала некую информацию об энергопоставках, представляющую государственную тайну. Впоследствии часть сведений (переговоры «Газпрома» с Молдавией и Крымом) признаны не секретными, и из обвинения их убрали».

«Я не сплю, жду людей в масках»

Квартира Карины недалеко от редакции. Почти два года назад (когда Цуркан только задержали) я уже побывала, так сказать, в «логове шпионки» — тогда меня пригласила ее мама. Помню огромную собаку Багиру, которая сбивает с ног любого входящего на порог. На этот раз Багиру заперли в комнате. Дверь открыла сама Карина.

— Непривычно видеть меня на свободе? — шутит она.

— А вы сами предполагали, что освободят?

— Даже мысли не было. Я сказала адвокатам, чтобы передали маме: пусть не приходит на заседания суда. Каждый раз это бывает болезненно: ее пускают только на оглашение (дело секретное), и так с надеждой смотрит, что сердце разрывается. Но мама все равно пришла 16 января (в день изменения меры пресечения). Я старалась казаться максимально бодрой. И тут я услышала непривычные фразы…

Каков бы ни был закон, мы все были в диком шоке. Мои подруги умудрились приехать через 10 минут, причем со всеми своими детьми, включая недавно рожденных, и отвезли меня домой. Эта история со мной показала, кто настоящие друзья, а кто нет. Ведь первое время я удивлялась — а куда все подевались, почему не пишут? А мне объяснили: «Ваше дело о шпионаже. Вы токсичны для людей. Даже знакомство с вами может принести неприятности».

— И что сделали первым делом на свободе?

— Обняла наконец маму. Уже дома обняла сына, который примчался из школы, и Багиру.

— Кстати, как она вас встретила?

— Это чудовище (смеется) повело себя так, будто я просто уходила на работу (а меня не было год и семь месяцев). Она посмотрела, нет ли у меня чего съестного в руках, и на этом ее интерес ко мне угас.

— Кстати, про съестное. В «Лефортово» вам было тяжелее других, потому что вы вегетарианка и не ели ту пищу, что там раздают заключенным. Наверное, отъедались дома?

— Я съела чечевицу и любимый сыр, который нельзя передавать в СИЗО. Собственно, тема еды меня мало волнует. Но вы правы абсолютно: 80 процентов разговоров в изоляторе — об этом.

— Дома на мягкой кровати спится наверняка лучше, чем на жестких нарах?

— А вот и нет. У меня бессонница. Часа в 3–4 утра начинаются панические атаки. Я смотрю на дверь комнаты и вспоминаю, как меня вытаскивали оттуда люди в масках. Помню испуганный вид мамы. Перед глазами стоит эта страшная картина.

— Представляю. Чем занимаетесь все последние дни на свободе?

— Просыпаюсь и еду в следственное управление ФСБ на ознакомление с материалами. Я каждый день туда хожу, а в СИЗО за последние два месяца меня вызвали всего несколько раз на ознакомление. Так что на свободе быстрее в пять раз.

«Эти год и семь месяцев в «Лефортово» никому не отдам»

— Мудрецы считают, что тюрьма — это не просто испытание, это возможность осознать то, чего, может быть, никогда не осознаешь на воле.

— Так и есть. Пришло понимание, что мы никогда не знаем, в какую ситуацию попадем. Моя пионерская категоричность ушла. Раньше я была уверена: человек должен поступать только так или иначе, и тогда все будет хорошо. Я поняла две вещи. Во-первых, не факт, что обязательно будет хорошо. Второе — никогда не знаешь, как поступил бы при определенных обстоятельствах.

Я раньше вообще не знала, что такое СИЗО. И когда мне сказали: «Или подпишешь, что скажем, и пойдешь под домашний арест — или отправишься в СИЗО», — я не поняла до конца смысл этих слов. А сейчас я понимаю, что абсолютно любой может оказаться в изоляторе, независимо от того, виновен или не виновен, просто попав в какие-то обстоятельства. Вот, пожалуй, так.

Я эти год и семь месяцев никому бы не отдала. Это самое важное время в моей жизни. Да, я столько никогда не плакала, как в эти год и семь месяцев. Но это были не только слезы горя, но и радости. Самый ценный опыт для жизни.

Фото: Ева Меркачева

— Слезы радости от чего были?

— Самое тяжелое в СИЗО — ты ничего не заешь о своих близких. Мама жива или нет? Что с сыном? Ты слышишь истории про других заключенных, которые пребывают в неведении, а потом появляется адвокат и сообщает скорбные вести. И ты в постоянной панике от этого. А я себя еще накручивала постоянно. И вот когда после всего выясняется, что мама в порядке, что сын передает пламенные приветы… Это такое счастье! А первые письма от подруг! А первое свидание (оно было через восемь месяцев после ареста). Все эти моменты безумно радостны.

А ограничения в СИЗО — это не страшно в моем случае. Я прекрасно существую в своем внутреннем мире и могу долго проводить время «сама в себе».

— Но ведь у вас была, можно сказать, невыносимая сокамерница — обвиняемая в теракте в петербургском метро Шохиста Каримова — которая ругалась матом, кричала, бесконечно смотрела ток-шоу по телевизору.

— Тяжело было ей, тяжело всем остальным. Но у меня нет негативных чувств к ней. И понимаю, что каждый из нас для кого-то из соседей не подарок. Ну вот возьмем меня. Я могу сидеть с книгой и молчать неделю. Кому это понравится?

— Кого-то из сокамерниц реально боялись?

— Не было такой. И ни одну я не могла сопоставить с образом зэчки. Все эти женщины — дочки, мамы. Все, кроме Шохисты, обвинялись по наркотическим статьям. С теми, кто попал за шпионаж и госизмену, меня не сажали — видимо, чтобы мы друг другу не «обменивались опытом». Шучу.

Одной из сокамерниц была хрупкая трогательная девушка, попавшая в беду. Ее жених находился тоже здесь, в «Лефортово». Оба попали в тяжелую ситуацию и нашли ошибочный выход из нее — наркотики. Ни в коем случае не надо оправдывать преступление (у меня сын подросток, я в ужасе от того, что происходит в стране с распространением наркотиков), но нельзя относиться ко всем как к заведомо потерянным личностям. У каждого свой крест, свой путь. Так вот они поженились в «Лефортово»!

— А кто-то из сотрудников у вас вызвал симпатию как человек?

— Да, и таких было немало. Я встречала даже тех, кто одним взглядом возвращал желание жить. И это правда, а не красивые слова. Конечно же, есть безразличные сотрудники, есть, так сказать, «работающие по внутреннему призванию». Но, повторюсь, больше тех, кто даже на такой работе остается человеком.

— А женщины-надзирательницы?

— Есть замечательные. Те, которые в баню выводят, и т.д. При этом некоторые сотрудницы привлекательные, ухоженные. Я смотрела на них и задала вопрос: почему они здесь? Но потом я поняла, что представление о сотрудниках — тоже мой стереотип.

— Как вам вообще жизнь в «Лефортово»?

— Первые несколько месяцев к тебе присматриваются — насколько ты можешь создать проблему в СИЗО. То, что реально нужно каждому новоприбывшему, — компетентный, грамотный психолог. Для меня шоком была первая встреча с психологом — это совсем молодой сотрудник (он уже больше не работает психологом, как я поняла, занимает другую должность). Первый разговор был удивительным.

— Он что, в качестве психотерапии предлагал написать признания и пойти на сделку со следствием?

— Нет, прямо так он не говорил. Я по своей наивности спросила: а сколько дней здесь буду? Он ответил: «В среднем 1,5 года. Но поговорите со следователем, может, найдете способ выйти раньше при определенных договоренностях». Я возмущалась: «Какие могут быть договоренности?». А он мне сказал, что письма будут идти долго, что свиданий, скорее всего, не будет.

Но, слава богу, он объяснил мне какие-то элементарные бытовые вещи.

— Например?

— Что женщина первым делом делает в камере? Старается отмыть пространство рядом. Все, что у меня было, это рулон туалетной бумаги, и я его использовала. А потом выяснилось, что это и есть тот самый рулон, который выдают тебе на два месяца.

«Я искусила человека на страшный грех — преступление»

— Вы говорили как-то, что знаете, кто стоит за вашим «шпионским делом».

— Я всегда настаивала на своей полной невиновности. У меня ни на каком этапе не было сомнений в том, кто из коллег стоит за этим делом против меня. Если бы была хоть малейшая возможность себя защитить и показать ситуацию реальную, не называя его имени, я бы это сделала. Нет ни малейшего негатива и желания отомстить. Но человек делает такое, что уничтожает не только меня, но и старую женщину и ребенка. Носить в себе столько ада при жизни — тяжело. Я ему не завидую.

— Вы не думаете, что он мог искренне считать вас шпионкой? И что дело не в конфликте, а в его убеждениях?

— Одно дело заблуждаться и сказать: вот Цуркан нехороший человек, и совсем другое — обвинить в страшнейшем (я лично считаю шпионаж и госизмену страшнейшими преступлениями).

Нет, дело в конфликте. Но я считаю, что в любом конфликте виноваты оба. В православии есть такое понятие — если кто-то совершил зло по отношению к тебе, то это ты искусил его на этот грех. Я понимаю, что я где-то своей избыточной гордыней искусила.

Первая попытка закинуть в ФСБ что-то, что меня бы дискредитировало и позволило убрать с должности, была в 2015 году. За мной наблюдали, меня прослушивали. Но тогда почему-то это не сработало. И я как работала с госорганами — правительством, министерствами, так и продолжала. И почему мне позволили находиться на всех важных совещаниях, погружаться в ряд серьезнейших для отрасли вопросов? Я была арестована только в июне 2018 года. Зачем понадобились три года?

— И почему, по-вашему, арест произошел в 2018 году?

— Сложился ряд факторов. Может быть, кто-то хотел перевести внимание на этот скандал, чтобы не увидели чего-то другого.

Очень грубо сделаны документы. Для меня это просто оскорбительно.

— Это вы про те документы, которые, по-вашему мнению, были сфальсифицированы и о которых вы говорили в недавнем обращении к президенту Владимиру Путину?

— Да. Главное доказательство — ксерокопия анкеты агента молдавской спецслужбы. В этом «документе», датированном 2004 годом, моя фотография с паспорта, сделанная только в 2008 году. Адрес, указанный в анкете, является моим с 2010 года (до этого я не могла даже знать, что буду там жить). Думаю, эта фальсификация произошла не без участия сотрудников силовых структур. Я говорю о двух-трех людях. Все остальные (а главное, их руководители) были искренне уверены, что нашли шпиона.

Я письменно обратилась в УСБ, попросила организовать мне встречу с ними. Я готова им рассказать про тех сотрудников, что могут быть причастны к фальсификации. Ответа до сих пор не получила. Жду.

— Но копия странной анкеты — надо полагать, не единственное доказательство. А как же перехваченные российской разведкой донесения молдавских спецслужб в НАТО (одно — о поставках российского газа в Молдавию, второе — о поставках электроэнергии в Крым)?

— Это ужасно плохо читаемые три копии материалов на английском языке. Сами материалы — перевод засекреченных писем министра энергетики России и его заместителя. Но я доступа к ним не имела, и вообще у меня никогда не было допуска к гостайне. Важный момент: есть рапорт сотрудников ФСБ своему руководству о том, что якобы в 2012 году я имела допуск. Но в том же документе в конце сказано, что такой допуск никогда не оформлялся. Как вам «ошибочка»?

Как я поняла, доступ к этим письмам имела внутренняя служба безопасности Минэнерго и кураторы от ФСБ (часто видела их в коридорах министерства).

Следствие на первоначальном этапе запросило внутреннее подразделение нашей службы — что плохого можете про нее сказать? И это подразделение шлет семь писем, в которых упоминаются имена, связанные с Молдавией. И там такая небрежность — пишут, что вот человек из госорганов, а его супруга такая-то (а они не муж и жена и вообще друг друга не знают), министерство экономики называется министерством финансов и т.д.

Сотрудник молдавской разведки некий Александр Попеску якобы завербовал меня в 2004 году, и все это время со мной взаимодействовал. Я с первого дня просила: покажите мне его. Вдруг я его знала под другим имением? Оказалось, в глаза не видела. И он СМИ сказал, что не знает, кто я такая.

Экс-советник председателя РАО «ЕЭС России», в прошлом министр национальной безопасности Молдавии, Валерий Пасат якобы продвигал меня по карьерной лестнице. Ему дозвонились журналисты, и он им ответил в духе, что помогать моей карьере в то время не мог, потому что… сидел в молдавской тюрьме.

— Почему вас все-таки отпустили из СИЗО и даже не запретили общаться со СМИ? Может, это как раз надежда на хороший поворот?

— Не знаю. Но надежда, конечно, есть.

У меня нет вопросов к следователю — умный, интеллигентный человек. Я убеждена, что у следствия есть понимание реальной ситуации. Сказать: «Да, мы погорячились»?! Допустить, чтобы меня отпустили по реабилитирующим обстоятельствам? Но в таком случае человек имеет право на все компенсации.

— А не по реабилитирующим?

— Это как? Признать, что я шпионка, но чуть-чуть, не сильно?

— Как воспримите, если вас отправят 7 февраля обратно в СИЗО?

— Как очередное испытание. Все эти испытания, безусловно, меня обогащают внутренне. И помятуя известную фразу «то, что нас не убивает, делает нас сильнее», я все время думаю: куда меня готовят? В космос?

Вся эта история со мной показала мне: если мы источаем страх, то создаем ситуацию, в которой мы обязаны будем бояться и дальше. Я больше не хочу бояться.

Читайте также: «Дай бог, чтобы пытали только так»: ядовитые будни «изменников родины»

Провозглашение независимости Республики Узбекистан 31 августа 1991 г.

Республика Узбекистан признавала территориальную целостность и суверенитет Республики Каракалпакстан в составе Республики Узбекистан. За Каракалпакстаном сохранялось право свободного выхода из состава республики в соответствии с законодательством.

Предшествовавшее решению об объявлении независимости республики введение на территории СССР режима чрезвычайного положения в Узбекистане встретили по разному. 19 августа Узбекская демократическая партия «Эрг» («Воля») расценила отстранение от власти президента СССР Михаила Горбачева и образование Государственного комитета по чрезвычайному положению как антиконституционную акцию. «Эрг» заявила о намерении сотрудничать со всеми демократическими силами, выступающими против посягательств на государственный суверенитет Узбекистана и законные интересы республики.

В то же время в заявлении правительства Узбекистана ситуация в стране была расценена как «исключительно противоречивая». В такой ситуации, говорилось в документе, следует сохранять и укреплять общественно‑политическую стабильность.

28 августа 1991 года председатель ВС Узбекистана Ислам Каримов выразил несогласие с московским решением о приостановлении деятельности КПСС и заявил об отделении от нее Коммунистической партии Узбекистана (КПУ).

На состоявшемся в Ташкенте объединенном пленуме Центрального комитета (ЦК) и Центральной контрольной комиссии (ЦКК) Компартии Узбекистана было принято решение прекратить всякие связи с ЦК КПСС и выйти из всех структур КПСС. На пленуме было заявлено, что Компартия Узбекистана, ее руководящие органы полностью отмежевываются от всех злодеяний, извращений, преступных действий бывших руководителей ЦК КПСС, Политбюро и Секретариата ЦК.

Компартия республики должна стать независимой политической организацией, способной взять на себя ответственность за судьбу ее членов, будущее республики и народа.

14 сентября на съезде КПУ было объявлено о ее самороспуске и был образован организационный комитет по созданию Народно‑демократической партии Узбекистана (НДПУ).

Материал подготовлен на основе информации открытых источников

Карина Канеллакис

Положения и условия

Несмотря на тщательный контроль, Карина Канеллакис настоящим категорически отказывается от содержания всех связанных или связанных страниц, которые были изменены с момента создания ссылки. Это заявление относится ко всем ссылкам и ссылкам. За любое незаконное, неточное или неполное содержание, и особенно за ущерб, возникший в результате использования или неиспользования таких форм представленной информации, ответственность несет исключительно провайдер соответствующей страницы, а не сторона, просто ссылающаяся через ссылки на соответствующее издание.

Карина Канеллакис старается уважать авторские права на графические изображения, звуковые документы, видеопоследовательность и тексты, которые она использует.

Карина Канеллакис прямо оставляет за собой право без предварительного уведомления изменять, дополнять или отменять части страниц либо временно или навсегда прекратить публикацию.

Политика конфиденциальности

Дата вступления в силу: 26 июля 2018 г.

Карина Канеллакис («мы», «мы» или «наш») управляет karinacanellakis.com («Сервис»).

Эта страница информирует вас о нашей политике в отношении сбора, использования и раскрытия личных данных при использовании нашего Сервиса, а также о вариантах выбора, которые вы связали с этими данными.

Мы используем ваши данные для предоставления и улучшения Сервиса. Используя Сервис, вы соглашаетесь на сбор и использование информации в соответствии с этой политикой. Если иное не определено в настоящей Политике конфиденциальности, термины, используемые в настоящей Политике конфиденциальности, имеют то же значение, что и в наших Положениях и условиях, доступных через karinacanellakis.com

1. Сбор и использование информации

Мы собираем несколько различных типов информации для различных целей, чтобы предоставить вам и улучшить наш Сервис.

Типы собираемых данных:

1.1 Персональные данные

При использовании нашего Сервиса мы можем попросить вас предоставить нам определенную личную информацию, которая может быть использована для связи или идентификации вас («Личные данные»). Информация, позволяющая установить личность, может включать, но не ограничивается:

— Адрес, штат, провинция, почтовый индекс, город
— Файлы cookie и данные об использовании

1.2 Данные об использовании

Мы также можем собирать информацию о том, как осуществляется доступ к Службе и как она используется («Данные об использовании»). Эти данные об использовании могут включать такую информацию, как адрес интернет-протокола вашего компьютера (например, IP-адрес), тип браузера, версия браузера, страницы нашего Сервиса, которые вы посещаете, время и дата вашего посещения, время, проведенное на этих страницах, уникальные идентификаторы устройств и другие диагностические данные.

1.3 Отслеживание и данные файлов cookie

Мы используем файлы cookie и аналогичные технологии отслеживания для отслеживания активности в нашем Сервисе и хранения определенной информации.

Файлы cookie

— это файлы с небольшим объемом данных, которые могут включать анонимный уникальный идентификатор. Файлы cookie отправляются в ваш браузер с веб-сайта и хранятся на вашем устройстве. Также используются технологии отслеживания: маяки, теги и скрипты для сбора и отслеживания информации, а также для улучшения и анализа нашего Сервиса.

Вы можете указать своему браузеру отказаться от всех файлов cookie или указать, когда они отправляются. Однако, если вы не принимаете файлы cookie, вы не сможете использовать некоторые части нашего Сервиса.

Примеры файлов cookie, которые мы используем:

— файлы cookie, используемые Google Analytics (см. Ниже)

2. Использование данных

karinacanellakis.com использует собранные данные для различных целей:

— Для предоставления и поддержки Сервиса
— Для предоставления анализа или ценной информации, чтобы мы могли улучшить Сервис
— Для мониторинга использования Сервиса
— Для обнаружения, предотвращения и решения технических проблем

3. Передача данных

Ваша информация, включая Персональные данные, может передаваться и храниться на компьютерах, расположенных за пределами вашего штата, провинции, страны или другой государственной юрисдикции, где законы о защите данных могут отличаться от законов вашей юрисдикции.

Если вы находитесь за пределами США и решили предоставить нам информацию, обратите внимание, что мы передаем данные, включая Персональные данные, в Соединенные Штаты и обрабатываем их там.

Ваше согласие с настоящей Политикой конфиденциальности, за которым следует предоставление такой информации, означает ваше согласие на такую передачу.

karinacanellakis.com предпримет все разумно необходимые шаги для обеспечения безопасного обращения с вашими данными в соответствии с настоящей Политикой конфиденциальности, и передача ваших Персональных данных в организацию или страну не будет происходить, если не будет обеспечен надлежащий контроль, включая безопасность ваших данных и другой личной информации.

4. Раскрытие данных

4.1 Требования законодательства

karinacanellakis.com может раскрывать ваши Персональные данные, если добросовестно полагает, что такие действия необходимы для:

— Соблюдать юридическое обязательство
— Защищать права или собственность karinacanellakis.com
— предотвращать или расследовать возможные правонарушения в связи с Сервисом
— Для защиты личной безопасности пользователей Сервиса или общества
— Для защиты от юридической ответственности

5.Безопасность данных

Безопасность ваших данных важна для нас, но помните, что ни один метод передачи через Интернет или метод электронного хранения не является безопасным на 100%. Хотя мы стремимся использовать коммерчески приемлемые средства для защиты ваших Персональных данных, мы не можем гарантировать их абсолютную безопасность.

6. Поставщики услуг

Мы можем нанимать сторонние компании и частных лиц для содействия нашему Сервису («Поставщики услуг»), для предоставления Сервиса от нашего имени, для оказания услуг, связанных с Сервисом, или для помощи нам в анализе того, как используется наш Сервис.

Эти третьи стороны имеют доступ к вашим Персональным данным только для выполнения этих задач от нашего имени и обязаны не раскрывать и не использовать их для каких-либо других целей.

6.1 Аналитика

Мы используем Google Analytics для мониторинга и анализа использования нашего Сервиса. Google Analytics — это служба веб-аналитики. Вы можете посетить страницу с их политикой конфиденциальности здесь: https://policies.google.com/privacy?hl=en

7. Ссылки на другие сайты

Наш Сервис может содержать ссылки на другие сайты, которыми мы не управляем.Если вы нажмете на стороннюю ссылку, вы будете перенаправлены на сайт этой третьей стороны. Мы настоятельно рекомендуем вам ознакомиться с Политикой конфиденциальности каждого сайта, который вы посещаете.

Мы не контролируем и не несем ответственности за содержание, политику конфиденциальности или действия любых сторонних сайтов или служб.

8. Конфиденциальность детей

Наша Служба не предназначена для лиц младше 16 лет («Дети»).

Мы сознательно не собираем личную информацию от лиц младше 16 лет.Если вы являетесь родителем или опекуном и знаете, что ваши Дети предоставили нам Личные данные, свяжитесь с нами. Если нам станет известно, что мы собрали Персональные данные от детей без подтверждения согласия родителей, мы предпримем шаги для удаления этой информации с наших серверов.

9. Изменения в настоящей Политике конфиденциальности

Время от времени мы можем обновлять нашу Политику конфиденциальности. Мы сообщим вам о любых изменениях, разместив новую Политику конфиденциальности на этой странице.

Мы сообщим вам об этом по электронной почте и / или в заметном уведомлении о нашем Сервисе до того, как изменения вступят в силу, и обновим «дату вступления в силу» в верхней части настоящей Политики конфиденциальности.

Рекомендуется периодически просматривать эту Политику конфиденциальности на предмет изменений. Изменения в этой Политике конфиденциальности вступают в силу, когда они публикуются на этой странице.

10. Свяжитесь с нами

Если у вас есть какие-либо вопросы по поводу настоящей Политики конфиденциальности, свяжитесь с нами:
По электронной почте:

[email protected]
[email protected]

Незаконные Cre-зависимые хромосомные перестройки в сперматидах трансгенных мышей

Джастин Р.Дэвис, Эндрю К. Джайлс, Кэтрин Х. Ранкин, Джонатан Белл, Хироши Кимура, Тадаши Уэмура, Йоши Кидокоро, Мадо Лемье, Поль Де Конинк, Эмилио Карбоне, Адриано Сенаторе, Дж. Дэвид Спаффорд, Меган Дж. Дауи, Наташа Л. Гримси *, Мишель Гласс, Кевин Д. Гиллис, Питер Хантер, Брайан Баджелл, Ариджит Рой, Ричард Дж. А. Уилсон, Окихиде Хикосака, Майкл Эсфельд, Йенс Харбеке, Такаюки Мицухаси, Такао Такахаши, Рёитиро Кагеяма, Питер Такаши, Рёитиро Кагеяма, Рёсукэ Лалли, Майкл Н. Нитабах, Джулиан Ф.Р. Патон, Дэвид М. Вайцман, Юджин Натти, Айхуа Ли, Икуо Цунода, Микако Кобаяши-Уоррен, Джейн Э. Либби, Роберт С. Фуджинами, Амод П. Кулкарни, Лори А. Келлауэй, Гириш Дж. Котвал, Катрин Э. .Морген, Мария Грация Чуфолини, Лоредана Николетти, Рэндалл Л. Дэвис, Маркус Дж. Хофер, Иэн Л. Кэмпбелл, Троелс С. Йенсен, Нанна Б. Финнеруп, Волко А. Штрауб, Эдуардо Э. Бенаррох, Адольфо М. Бронштейн, Антуан Ниссан, Джеймс Р. Блодель, Властислав Браха, Стивен М. Хайштейн, Чарльз А. Скаддер, Тора М.Качур, Дэйв Б. Пилигрим, Холли Андре, Джозеф А. Минделл, Мерритт Мадьюк, Джон Ормонд, Мелани А. Вудин, Субимал Датта, Дэвид Д. Эйзенстат, Кааре Северинсен, Йоханнес Якобсен, Марта Мерроу, Тилль Реннеберг, Джеффри Д. Шалл , Брент А. Фогт, Роберт Дж. Моркрафт, Шелли Тишкау, Менно П. Геркема, Рууд М. Буйс, Альфред Дж. Леви, Дэвид Хазлеригг, Такаши Ямамото, Марсело Эпштейн, Шелли Тишкау, Юрген А. Риппергер, Урс Альбрехт, Ахим Крамер, Урс Альбрехт, Юрген А. Риппергер, Марио А. Руджеро, Роберт В.Шеннон, Мануэль С. Мальмерка, Филип Х. Смит, Беата Содиан, Андреас Нидер, Фред В. Маст, Бен Годде, Торстен Хансен, Карл Р. Гегенфуртнер, Филипп Фор, Дуглас В. Аллан, Хидеки Асо, Уилфрид Джениг, Илья А. Рыбак, Джеффри С. Смит, Амир Карниэль, Витторио Сангинети, Фиона Мансерг, Джонатан Р. Волпоу, Деннис Дж. МакФарланд, Такаши Ямамото, Денис Марешаль, Надя Альтхаус, Марсело Эпштейн, Тай Синг Ли, Марсело Эпштейн, Марсело Эпштейн А. Клеланд, Грэм К. Гудвин, Ари Фойер, Марк Л. Латаш, Оскар Марин, Пол Дж.Лукассен, Карин Бекхорн, Фиона Фрэнсис, Хенк Дж. Гроеневеген, Хисаши Огава, Воан Дж. Мейсфилд, Ингварс Бирзниекс, Мартин Биль

2009 г.

Произошла ошибка при настройке вашего пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее частые причины:

В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в cookie-файлах может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Идентификация и характеристика новых филамент-образующих белков у цианобактерий

Abstract

Филамент-образующие белки у бактерий функционируют в стабилизации и локализации белковых комплексов и репликонов; следовательно, они играют важную роль в бесчисленных клеточных процессах, таких как деление и рост клеток.Здесь мы представляем два новых белка, образующих волокна у цианобактерий. Изучая геномы цианобактерий на наличие белков, богатых спиральной спиралью (CCRP), которые предположительно являются белками, образующими нити, мы наблюдали более высокую долю CCRP в нитчатых цианобактериях по сравнению с одноклеточными цианобактериями. Используя наши прогнозы, мы идентифицировали девять семейств белков с предполагаемыми свойствами промежуточных филаментов (IF). Анализы полимеризации выявили четыре белка, которые образовывали полимеры in vitro , и три белка, которые образовывали полимеры in vivo .Fm7001 из Fischerella muscicola PCC 7414 полимеризовал in vitro и образовал нити in vivo в нескольких организмах. Кроме того, мы идентифицировали тетратрикопептидный повторяющийся белок — All4981 — в Anabaena sp. PCC 7120, который полимеризовался в нити in vitro и in vivo . All4981 взаимодействует с известными белками цитоскелета и необходим для жизнеспособности Anabaena . Хотя он не образовывал филаментов in vitro , Syc2039 из Synechococcus elongatus PCC 7942, собранных в филаменты in vivo , и мутант syc2039 Δ характеризовался нарушенным цитокинезом.Наши результаты расширяют репертуар известных прокариотических нитевидных CCRP и демонстрируют, что цианобактериальные CCRP участвуют в морфологии, подвижности, цитокинезе и целостности колонии клеток.

Тематические термины: Клеточная микробиология, бактериальная генетика

Введение

Виды в типе Cyanobacteria имеют широкое морфологическое разнообразие, от одноклеточных до многоклеточных организмов. Одноклеточные цианобактерии родов Synechocystis и Synechococcus характеризуются круглой или палочковидной морфологией, соответственно, и многие штаммы подвижны.Виды отряда Nostocales являются многоклеточными и различают три типа специализированных клеток, включая гетероцисты, которые фиксируют атмосферный азот в аэробных условиях, гормогонии, представляющие собой репродуктивные подвижные филаменты, и акинеты, которые представляют собой спящие клетки, устойчивые к высыханию. Внутри Nostocales виды Nostocaceae (например, Anabaena , Nostoc ) образуют линейные трихомы, в то время как клетки Hapalosiphonaceae и Chlorogloepsidaceae делятся более чем в одной плоскости, образуя трихомы с истинным ветвлением, как в случае Fischerellaiser . (более одной нити подряд), как в случае Chlorogloeopsis ^¹.Примечательно, что клетки внутри одного трихома многоклеточной цианобактерии могут различаться по размеру, форме или составу клеточной стенки, что может быть отнесено к разным стадиям дифференцировки клеток (или фенотипической гетерогенности) и различным признакам окружающей среды ^{², ³} . Клетки в Anabaena sp. Трихомы PCC 7120 (далее Anabaena ) связаны общим пептидогликановым листом и внешней мембраной ^⁴. Клетки Anabaena связываются и обмениваются питательными веществами через межклеточные межклеточные соединения, называемые межклеточными соединениями, которые, как полагают, содержат белки септальных соединений SepJ, FraC и FraD ^{⁵, ⁶}.SepJ важен для многоклеточного фенотипа у Anabaena ^{⁷, ⁸}.

Исследования молекулярных основ морфогенеза цианобактерий до сих пор были сосредоточены на функции FtsZ и MreB, прокариотических гомологов тубулина и актина, соответственно ^⁹. FtsZ функционирует в составе мультибелкового комплекса, называемого дивисомой, и известен как ключевой регулятор клеточного деления и биогенеза перегородочного пептидогликана (PG) ^{⁹, ¹⁰}.Было показано, что FtsZ является важным клеточным белком у Anabaena и коккоидной цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803 (далее Synechocystis ) ^¹¹. Концентрация FtsZ в клетках Anabaena строго контролируется пока не описанной протеазой ^¹². Помимо своей функции в делении клеток, FtsZ-управляемый дивисома также обеспечивает локализацию SepJ ^¹³.MreB функционирует в составе мультибелкового комплекса, называемого элонгасомой, где он является ключевым медиатором продольного биогенеза PG, который контролирует форму клетки ^{⁹, ¹⁴}. У цианобактерий MreB играет роль в определении формы клеток в Anabaena , тем не менее, он не важен для жизнеспособности клеток ^¹⁵. Напротив, у Synechococcus sp. PCC 7942 (далее Synechococcus ) MreB необходим, если частично сегрегированные мутанты демонстрируют кокковидную морфологию, напоминающую морфологию E.coli mreB делеционные штаммы ^{¹⁶, ¹⁷}. В Nostoc punctiforme ATCC 29113 было показано, что оперон MreBCD регулируется гормогоний-специфическим сигма-фактором SigJ и, вероятно, участвует в переходе коккоидных вегетативных клеток в более палочковидные клетки, характерные для гормогонии ^¹⁸.

Белки, похожие на эукариотические промежуточные филаменты (IFs), были обнаружены у нескольких видов бактерий и, как было показано, образуют филаменты in vitro и in vivo и влияют на основные клеточные процессы ^¹⁹.ПФ-белки проявляют внутреннюю нуклеотид-независимую способность in vitro к полимеризации , которая опосредована высокой частотой областей, богатых спиральной спиралью, в их аминокислотной последовательности ^{⁹, ²⁰—²²}. Белки ПФ эукариот обычно характеризуются накоплением консервативных доменов, состоящих из прерывистых спиральных сегментов, которые образуют центральный стержневой домен. Этот стержневой домен на N- и C-конце фланкирован глобулярными доменами головы и хвоста переменной длины ^{²² — ²⁴}.Кресцентин представляет собой бактериальный IF-подобный CCRP из Caulobacter crescentus , который проявляет поразительное сходство домена с эукариотическими белками IF. Филаменты полумесяца, которые выравниваются по внутренней кривизне клетки, важны для типичной серповидной формы клеток C. crescentus ; возможно, посредством локального воздействия сужающей силы, которая координирует механизм синтеза пептидогликана (PG), управляемый MreB ^{²⁵—²⁷}. Напоминающий эукариотические белки IF, Crescentin, как было обнаружено, собирается в нитевидные структуры in vitro нуклеотид-независимым образом ^²⁵.Однако до сих пор гомологи Crescentin не были обнаружены у других бактерий, что указывает на то, что несферическая или палочковидная морфология прокариот предположительно контролируется другими полимеризующимися белками ^{²⁸, ²⁹}. Помимо Crescentin, многие другие coiled-coil-rich белки (CCRP) с IF-подобными функциями были идентифицированы как полимеризующиеся в нитчатые структуры и выполняющие цитоскелетоподобные роли; однако ни один из них не напоминал архитектуру эукариотического домена IF (обзор Lin & Thanbichler (2013) ^¹⁹).Примерами являются два белка из Streptomyces coelicolor , функция которых была изучена более подробно: FilP и Scy ^{²⁹ — ³¹}. Градиенты FilP локализуются на кончике растущих гиф и способствуют клеточной жесткости ^²⁹. Scy формирует пятнистые кластеры в местах образования новых кончиков и вместе с каркасом CCRP DivIVA управляет ростом полярных гиф ^³⁰. Вместе с FilP и целлюлозосинтазой эти белки образуют полярисому, которая направляет биогенез пептидогликана и рост кончика гиф в S.coelicolor ^{³⁰, ³², ³³}. Другим примером являются четыре CCRP в патогене человека Helicobacter pylori , которые, как было обнаружено, собираются в филаменты in vitro и in vivo , с функцией определения спиральной формы клеток, а также подвижности клеток ^{³⁴ , ³⁵}. Следовательно, формирующие филаменты CCRPs с основными клеточными функциями были обнаружены у многих прокариот, имеющих различную клеточную морфологию.Присутствие образующих нити CCRP у цианобактерий до сих пор недостаточно изучено. Здесь мы ищем CCRP с предполагаемыми IF-подобными функциями у цианобактерий, используя вычислительное предсказание CCRP. Предполагаемые белки, образующие нити, были дополнительно исследованы экспериментально с помощью структурных анализов и анализов локализации in vitro, и in vivo, в морфологически разнообразных цианобактериях.

Результаты

Белки, богатые спиральной спиралью, широко распространены в цианобактериях

Для компьютерного прогнозирования предполагаемых белков, образующих филаменты, мы исследовали 364 генома цианобактерий, включая 1225314 белок-кодирующих последовательностей (CDS) на предмет CCRP.Все CDS в геномах цианобактерий были сгруппированы по сходству последовательностей в семейства гомологичных белков (см. Методы). Частота CCRP в каждой CDS была рассчитана с использованием алгоритма COILS ^³⁶. Алгоритм дал список из 28 737 CDS с высоким содержанием coiled-coil (≥80 аминокислот в конформации coiled-coil; дополнительный файл ¹). CCRP были предсказаны для 158 466 семейств белков, охватывающих все виды цианобактерий. Чтобы изучить общее распределение CCRP в геномах цианобактерий, мы исследовали 1504 семейства гомологичных белков, которые включают не менее трех членов CCRP (рис.). Примечательно, что большинство семейств белков (1142; 76%) включают членов CCRP и не-CCRP, что указывает на то, что содержание спиральной спирали может различаться среди гомологичных белков. Характер присутствия / отсутствия семейств, включающих CCRP, также показывает, что они менее распространены в геномах пикоцианобактерий (группа SynProCya) по сравнению с остальными видами в филуме. Кроме того, доля CCRP в геноме значительно выше у многоклеточных цианобактерий по сравнению с одноклеточными цианобактериями (P = 2.65 × 10 ⁻⁴⁶ с использованием критерия Краскела-Уоллиса и критерия Тьюки с α = 0,05). Это указывает на то, что высокая частота CCRP является одной из характеристик многоклеточных цианобактерий.

Распределение семейств белков CCRP внутри цианобактерий. ( A ) Линии в матрице присутствия / отсутствия обозначают геномы цианобактерий; каждый столбец показывает семейство белков. Серые точки обозначают любой гомологичный белок в том же семействе белков, а черные точки представляют членов CCRP. Семейства белков отсортированы по количеству членов.Размер семейства белков и количество членов CCRP представлены на гистограмме выше. ( B ) Доля семейств белков, содержащих CCRP (серый цвет) и белки CCRP (черный) в каждом геноме. ( C ) Характер наличия / отсутствия семейств белков-кандидатов CCRP. Показаны только белковые семейства, по крайней мере, с тремя членами, которые предположительно являются CCRP. ( D ) Предсказание домена кандидатов CCRP. Шкала сверху дана в аминокислотных остатках. Аминокислотные последовательности в конформации «спиральная спираль» изображены черными полосами, а последовательности «спиральная спираль» представлены черными линиями.Тетратрикопептидные повторы (TPR), также предсказанные алгоритмом COILS, показаны серыми столбцами. Белки представлены в виде тегов локуса цианобаз. Fm7001 и Fm6009 соответствуют номерам доступа NCBI {«type»: «entrez-protein», «attrs»: {«text»: «WP_016868005.1», «term_id»: «515362029», «term_text»: «WP_016868005.1 «}} WP_016868005.1 и {» type «:» entrez-protein «,» attrs «: {» text «:» WP_020476706 «,» term_id «:» 521965101 «,» term_text «:» WP_020476706 «}} WP_020476706, соответственно. Сокращения: Cau: C. crescentus ; Syc: Synechococcus , Syn: Synechocystis ; Ана: Анабаена ; The: Thermosynechococcus elongatus BP-1; Fis: Fischerella .Цианобактериальные CCRP имели консервативные домены, присутствующие в прокариотических IF-подобных CCRP и эукариотических IF-белках (дополнительная таблица ¹). Наличие структурной поддержки домена хромосом (SMC) или структурное сходство с белком деления клетки EzrA обозначается « X », отсутствие обозначается « — ». Полный список приведен в дополнительной таблице ¹.

Для экспериментальной проверки полный список CCRP был отфильтрован для включения кандидатов из пресноводных одноклеточных и нитчатых цианобактерий, которые являются генетически доступными, в том числе Thermosynechococcus elongatus BP-1 ( Thermosynechococccus ), Synechocystis Synechocystis Anabaena и Fischerella muscicola PCC 7414 ( Fischerella ).Помимо функций цитоскелета, coiled-coils являются общими мотивами белков, участвующих в др. Клеточных процессах, таких как транскрипция, внеклеточный матрикс, хемотаксис и взаимодействия хозяин-патоген ^³⁷. Следовательно, оставшиеся CCPR были дополнительно отсортированы для включения белков, обладающих свойствами, аналогичными известным прокариотическим IF-подобным CCRP (например, Crescentin, FilP), и аннотированы как гипотетические белки с неизвестной функцией. Кроме того, были исключены белки, лишенные неструктурированной N-концевой головки и C-концевого хвостового домена, которые являются характеристиками прокариотических IF-подобных белков ^²⁹.Кроме того, были исключены белки с назначенной функцией или предположительно участвующие в других клеточных процессах (с использованием общедоступных онлайн-биоинформатических инструментов: NCBI Blast, NCBI CD search, PSORTb, TMHMM, InterPro, PSIPRED и I-TASSER). При скрининге характеристик и аннотаций белков в качестве эталонов для наших прогнозов были выбраны Crescentin, FilP и другие эукариотические IF-белки (например, Vimentin и Desmin), в которых предпочтение отдавалось белкам, показывающим аналогичные результаты. Дополнительный CDS Fischerella , Fm7001, был добавлен в список, поскольку более ранние исследования показали, что он имеет функцию определения формы клеток.Предварительная фильтрация привела к списку из девяти кандидатов, который мы исследовали здесь экспериментально (рис. И дополнительная таблица ¹).

Кодирующие последовательности-кандидаты различались по размеру и варьировались от прибл. От 280 аминокислот (Synpcc7942_2039, сокращенно Syc2039) до прибл. 650 аминокислот (Все 4981). Распределение доменов coiled-coil было различным среди кандидатов как по количеству доменов coiled-coil, так и по длине (рис.). Только Slr7083 обнаруживает в некоторой степени характерную доменную архитектуру эукариотических белков IF, тогда как распределение доменов спиральной спирали у других кандидатов имело большие различия в количестве и длине доменов спиральной спирали.Ни один из предсказанных CCRP не показал структуру, подобную заиканию в последнем сегменте спиральной катушки. Помимо доменов coiled-coil, алгоритм COILS также предсказал тетратрикопептидные повторы (TPR) в виде спиральных спиралей, поэтому мы также включили All4981 в наш анализ, хотя поиск по консервативным доменам надежно предсказал эти домены как TPR, а не coiled-coils. Многие белки-кандидаты содержали консервативные домены из эукариотических белков IF, обнаруженных в Crescentin и FilP, или из белка деления бактериальных клеток EzrA (дополнительная таблица ¹).Наличие этих доменов можно рассматривать как поддержку нашей классификации. Кроме того, структурное поддержание доменов хромосом (SMC) было предсказано почти для всех выбранных кандидатов, всех эукариотических белков IF, а также для Crescentin и FilP (дополнительная таблица ¹). Домен MscS_TM из Desmin был обнаружен в Slr7083, а Tlr0420 содержит домен Neuromodulin_N, а также домен CCDC158, оба присутствующие в FilP или Crescentin, соответственно.

Присутствие гомологов во всех морфотипах цианобактерий служит намеком на универсальную функцию белка, в то время как ограниченное распределение в конкретных подсекциях или морфотипах указывает на функциональную специализацию внутри соответствующего таксона.Примером такого видоспецифичного кандидата в нашем списке является slr7083 , который кодируется на токсин-антитоксиновой плазмиде pSYSA в Synechocystis , аналогично parM и tubZ , которые опосредуют сегрегацию плазмиды ^{^{382 39}}. Synpcc7942_1139 и Slr1301 являются гомологами ранее охарактеризованного белка подвижности HmpF из N. punctiforme , поэтому мы называем их здесь HmpF _Syn и HmpF _Syc, соответственно, чтобы подчеркнуть их взаимосвязь.В отличие от slr7083 , гомологичные белки HmpF _Syn и HmpF _Syc являются высококонсервативными и имеют гомологи среди всех цианобактериальных групп, но отсутствуют в пикоцианобактериальных (рис.; Дополнительный файл ²). Поскольку большинство кандидатов CCRPs аннотированы как гипотетические белки, мы первоначально проверили транскрипцию соответствующих генов с помощью RT-PCR с кДНК (дополнительный рисунок ^{1A – D}). Наши результаты показали, что slr7083 транскрибируется только слабо во время фазы среднего экспоненциального роста культуры, а all4981 транскрибируется в опероне с его вышестоящими генами all4982 и all4983 (дополнительный рис.^{1Б, С}).

Цианобактериальные CCRP собираются в различные филаментоподобные структуры

in vitro
Основной характеристикой филамент-образующих белков является их способность самополимеризоваться в филаменты внутри и вне клетки ^{²², ⁴⁰}. В отличие от актина и тубулина, IFs способны образовывать нитевидные структуры in vitro нуклеотид-независимым образом без дополнительных кофакторов при ренатурации из денатурирующего буфера ^⁴⁰.Чтобы изучить свойство самополимеризации девяти протестированных CCRP, мы очистили CCRP с меткой His ₆ в денатурирующих условиях и подвергли их последующему ренатурированию диализом. Здесь мы использовали концентрации белка в аналогичном диапазоне (0,5–1 мг / мл ^-1) для ранее исследованных белков, которые, как было показано, образуют филаменты in vitro (например, Crescentin ^²⁵ и Scc ^⁴¹, метаболический фермент CtpS ^⁴² и бактофилины BacA, BacB ^⁴³ и BacM ^⁴⁴).При необходимости очищенные белки метили NHS-флуоресцеином, и образование нитей in vitro оценивали с помощью эпифлуоресценции или микроскопии в светлом поле. Несколько кандидатов не образовали различимых структур in vitro и, следовательно, были исключены из дальнейшего исследования (включая Slr6096, Tlr0420 и Fm6009; дополнительный рисунок ^2A). Остальные CCRPs собраны в очень разнообразные структуры in vitro (рис.). Прямой диализ Fm7001 из буфера с высоким содержанием мочевины в физиологический буфер приводил к осаждению белка.Однако при медленной ступенчатой ренатурации (удаление 0,5 M каждые 2 часа) Fm7001 полимеризовался в плоский двухмерный лист, плавающий поверх диализата в 4,5 M мочевины (дополнительный рис. ^2D). Мы рассмотрели возможность того, что эти структуры могут быть продуктом кристаллизованной мочевины, но контрольные эксперименты не выявили филаментов. Полимеризованный Fm7001 выявил двумерные нитевидные листы, а также одиночные нитевидные волокна (рис.). Аналогичные структуры наблюдались для очищенных Fm7001-GFP и MBP-Fm7001-His ₆ (дополнительный рис.^{2Е, Ф.}). Двумерный нитевидный узор наблюдался также для Slr7083, который образовывал одиночные, длинные и прямые струны, которые были соединены между собой двухмерными листами, тем самым создавая нерегулярную сетку (рис.). Точно так же All4981 собраны в взаимосвязанную сеть из тонких и одинарных нитевидных нитей (рис.). Гетерологичная экспрессия Syc2039-His ₆ в E. coli не удалась, но вместо этого мы успешно очистили Syc2039-GFP-His ₆ из Synechococcus .Картина полимеризации Syc2039-GFP-His ₆ выявила трехмерные листы сферической или клеточной формы (рис.). Однако мы отмечаем, что большая часть белка осаждается при ренатурации, поэтому маловероятно, что Syc2039 обладает in vitro и полимеризующими свойствами. HmpF _Syc полимеризовался в трехмерные листы, похожие на форму клеток, но без каких-либо обнаруживаемых агрегатов (рис.). Сходство между листами Syc2039 и HmpF _Syc повысило вероятность того, что пластинчатые структуры, наблюдаемые в образце Syc2039-GFP-His ₆, представляют собой соосажденный и полимеризованный HmpF _Syc.В соответствии с этим предположением, мы идентифицировали прямые взаимодействия HmpF _{, Syc} и Syc2039, используя анализы двухгибридной бактериальной аденилатциклазы (BACTH) (дополнительная фигура ^3A). Для HmpF _Syn не наблюдалось никаких четких структур in vitro (фиг.). Примечательно, что кресцентин, который мы использовали в качестве положительного контроля, полимеризовался в гладкие и филигранные нити только в присутствии одновалентных ионов (т.е. NaCl; дополнительный рис. ^2B). Это наблюдение подчеркивает важность подходящих буферных условий для обнаружения белков, образующих филаменты.Чтобы дополнительно подтвердить наши наблюдения in vitro , мы включили мономерный и хорошо растворимый мальтозосвязывающий белок (MBP), а также олигомерные белки GroEL1.2 ^⁴⁵ (из Chlorogloeopsis fritschii PCC 6912) и киназу UMP (из Anabaena ) в качестве отрицательного контроля. В то время как и MBP, и киназа UMP легко собирались в сравнительно небольшие агрегаты, GroEL1.2 образовывал большие белковые агрегаты in vitro , вероятно, в результате нескоординированной мультимеризации (дополнительный рис.^2С). Следовательно, мы заключаем, что in vitro нитевидные структуры цианобактериальных CCRPs, которые мы наблюдали здесь, вряд ли могут быть артефактами олигомеризации. Мы дополнительно подтвердили свойства самосвязывания остальных шести CCRP с помощью анализа BACTH и обнаружили, что все белки способны самовзаимодействовать (дополнительный рис. ^3A).
Цианобактериальные CCRPs собираются в разнообразные филаментоподобные структуры in vitro . Светлопольные и эпифлуоресцентные микрофотографии нитевидных структур, образованных очищенным и ренатурированным Fm7001-His ₆ (0.7 мг / мл ^-1), Slr7083-His ₆ (1 мг / мл ^-1), All4981-His ₆ (0,5 мг / мл ^-1), Syc2039-GFP-His ₆ ( 0,3 мг мл ^-1), HmpF _Syc -His ₆ (0,5 мг мл ^-1) и HmpF _Syn -His ₆ (0,5 мг мл ^-1). Белки диализовали в 2 мМ Трис-HCl, 4,5 М мочевины pH 7,5 (Fm7001), HLB (Slr7083), PLB (All4981, HmpF _Syc, HmpF _Syn) или BG11 (Syc2039).Ренатурированные белки либо непосредственно анализировали с помощью светлопольной микроскопии (Fm7001), либо окрашивали избытком NHS-флуоресцеина и анализировали с помощью эпифлуоресцентной микроскопии. Краситель NHS-флуоресцеин связывает первичные амины и, таким образом, несовместим с мочевиной, поэтому филаментоподобные структуры Fm7001 были визуализированы с помощью микроскопии в светлом поле. Масштабные линейки: 10 мкм или (вкладка Fm7001 и Slr7083) 20 мкм.
Предполагаемые белки, образующие нити, образуют подобные нити структуры
in vivo
Чтобы исследовать, влияет ли генетический фон на свойства полимеризации белков-кандидатов, мы экспрессировали конструкции трансляционного слияния GFP или YFP предполагаемых образующих нити CCRP в нескольких хосты: (1) E.coli , (2) их природные цианобактерии и (3) цианобактерии другого морфотипа или подсекции. Экспрессия генов управлялась индуцибельными или конститутивными промоторами, обычно используемыми в цианобактериях. К ним относятся P _cpc560 (для Synechocystis ) ^⁴⁶, P _trc (для E. coli , Synechocystis и Synechococcus ) ^{^{(для Anabaena и Fischerella ) ^⁴⁸.В качестве положительного контроля для полимеризации in vivo мы экспрессировали Crescentin-GFP в Anabaena , который образовывал в клетках круглые и спиральные филаментоподобные структуры, тем самым показывая, что P _petE подходит для изучения филамент-образующих IF- как CCRP в Anabaena . (Дополнительный рис. ^4A).}}
Fm7001 образует нитевидные структуры
in vivo независимо от хозяина
Локализация in vivo Fm7001 в Fischerella дала разные результаты в зависимости от ориентации метки.Только экспрессия N-концевых слияний YFP Fm7001 приводила к филаментоподобным структурам (Fig. And Supplementary Fig. ^4B). У Synechocystis YFP-Fm7001 образовывал филаментоподобные структуры по всей клетке (Рис.), Тогда как у Anabaena мы наблюдали нити, возникающие в виде перегородки (Рис.). В своем хозяине, Fischerella , YFP-Fm7001 лишь изредка собираются в короткие нитевидные нити (вкладки на рис.). Несмотря на низкое количество филаментоподобных структур у Fischerella , индукция гетерологичной экспрессии YFP-Fm7001 вызвала измененный фенотип клетки и трихомы, по-видимому, разделенные более чем в одной плоскости, что привело к многорядному (более одного трихома в ряду) фенотип, характерный для C.fritschii . В то время как в неиндуцирующих условиях (т.е. в отсутствие меди) клетки Fischerella , несущие плазмиду, экспрессирующую YFP-Fm7001 из P _petE, имели фенотип WT, измененный морфотип и многорядный рост наблюдали примерно после 4 раундов репликация (то есть через 7 дней) в индуцирующих условиях (рис.). Мы также наблюдали, что, хотя YFP-Fm7001 экспрессируется с ненативного промотора, изначально он локализовался в трихоме ветвления, близко к точкам ветвления предположительно развивающихся гормогоний (рис., 18 ч после индукции). Эти наблюдения предполагают, что Fm7001 может участвовать в контроле формы клеток, фенотипе ветвления или развитии гормогонии у Fischerella . Наши попытки создать мутантный штамм Fischerella ∆ fm7001 остались безуспешными, следовательно, функция Fm7001 остается неизвестной.
Независимость от хозяина для филаментации Fm7001 in vivo . Объединенная флуоресценция GFP и аутофлуоресценция хлорофилла (красный) и микрофотографии в светлом поле ( A ) Synechocystis , ( B ) Anabaena или ( C ) Fischerella m, экспрессирующих 700 YFP-F.Клетки выращивали в ( A , B ) BG11 или ( C ) BG11 без меди, а затем индуцировали 0,5 мкМ CuSO ₄. ( C ) Микрофотографии получали до индукции экспрессии yfp-fm7001 (без индукции) и через 18, 36 или 7 дней после индукции. Белые треугольники указывают на выбранные нитевидные нити YFP-Fm7001 внутри ячеек. Примечательно, что в отличие от Anabaena и Fischerella , Fm7001-GFP индуцировал набухший морфотип у E.coli и субпопуляция клеток Synechocystis (дополнительная фигура ^1E). ( B ) Проекция максимальной интенсивности Z-стека. Масштабные линейки: (A , B ) 5 мкм, ( C ) 10 мкм.
Slr7083 и HmpF
_Syn участвуют в подергивании подвижности у Synechocystis
Локализация in vivo Slr7083-GFP в Synechocystis показала, что он был локализован как в редких очагах, так и на периферии клеток. ячейка (рис.). Мы также попытались локализовать Slr7083-GFP в подвижном субштамме Synechocystis PCC-M (далее PCC-M), но так и не получили успешно трансформированного клона, что позволяет предположить, что чрезмерное присутствие Slr7083 вредно для этого штамма. Локализация HmpF _Syn -YFP в Synechocystis и PCC-M была на нечетких периферических участках в виде совокупностей серповидных форм и редко в виде фокальных пятен, охватывающих клетку (Рис. И Дополнительный Рис. ^4C).Ранее сообщалось о подобных структурах для пилуса ATPase PilB ^⁴⁹. Локализация Slr7083-GFP и YFP-Slr7083 в Anabaena была на периферии клетки (дополнительный рисунок ^4D). Более того, расширенная экспрессия YFP-Slr7083 в Anabaena изменяет клеточную морфологию и нарушает линейный паттерн роста трихома Anabaena (дополнительный фиг. ^4E). В E. coli , Slr7083-GFP локализован рядом с полюсами клетки (дополнительный рис.^1E). При экспрессии в E. coli , HmpF _Syn -GFP обнаруживал аналогичную полярную локализацию (дополнительный фиг. ^1E). Для дальнейшей оценки роли HmpF _Syn и Slr7083 в подвижности Synechocystis мы генерировали штаммы Synechocystis и PCC-M Δ slr7083 и Δ hmpF _Syn мутантных штаммов. Мутанты Synechocystis Δ slr7083 и Δ hmpF _Syn не выявили фенотипических дефектов по сравнению с WT (рис.). Напротив, мутант PCC-M Δ slr7083 характеризуется снижением моторики подергивания и дефектом цитокинеза (рис.). Мутантные клетки PCC-M Δ slr7083 часто полностью лишены внутреннего сигнала хлорофилла и не могут должным образом делить внутреннюю тилакоидную мембрану (что оценивается по отсутствию аутофлуоресценции хлорофилла) во время деления клеток (рис.). Точно так же мутант PCC-M Δ hmpF _Syn потерял свою подергивающую подвижность (рис.), Подтверждая предыдущие результаты для Synechocystis ^⁵⁰, а также для N.punctiforme Δ hmpF мутанты ^⁵¹. Попытки дополнить дефект подвижности мутанта PCC-M Δ hmpF _Syn путем экспрессии HmpF _Syn -YFP из плазмиды конъюгации pRL153 потерпели неудачу, возможно, из-за сравнительно высокой экспрессии HmpF _Syn. -YFP из P _trc (отметим, что P _trc не может регулироваться в Synechocystis ). Альтернативно, добавление флуоресцентного белка к С-концу HmpF _Syn могло также сделать его нефункциональным.Примечательно, что слияние C-конца GFP с HmpF из N. punctiforme оказалось функциональным ^⁵¹, что позволяет предположить, что HmpF _Syn- YFP, вероятно, также является функциональным, но комплементация предотвращается из-за его сверхэкспрессии. Дополнительные попытки дополнить мутант PCC-M Δ slr7083 ни разу не привели к появлению экзонъюгантов. Чтобы дополнительно изучить, как HmpF _Syn влияет на подвижность, мы проанализировали соосажденные белки HmpF _Syn -YFP, экспрессируемые в Synechocystis , с помощью масс-спектрометрии.Это выявило множественные предполагаемые партнеры по взаимодействию, участвующие в подвижности, включая белок подергивающейся подвижности (Slr0161), два метил-акцептирующих белка хемотаксиса (McpA и PilJ) и сборку пилуса типа IV ATPase PilB (Fig.). Взаимодействие HmpF _Syn с PilB вместе с их сходной локализацией in vivo побудило нас охарактеризовать взаимодействие обоих белков. С этой целью мы попытались экспрессировать PilB-GFP в мутантах Synechocystis WT и Δ hmpF _Syn и Δ slr7083 .У Synechocystis WT PilB-GFP локализовался на периферии клетки и часто образовывал серповидные образования (напоминающие HmpF _Syn -YFP и Slr7083-GFP; рис.), Подтверждая предыдущие результаты ^⁴⁹. Однако мы никогда не наблюдали какой-либо экспрессии PilB-GFP в мутантах Synechocystis или PCC-M Δ slr7083 и Δ hmpF _Syn (дополнительная фигура ⁵), а несколько полученных экзонъюгантов никогда не были жизнеспособными. при повторном нанесении штрихов на свежие селективные чашки или переносе в жидкую питательную среду.Сходство между нашими наблюдениями для HmpF _Syn и Slr7083 привело нас к проверке взаимодействия между этими двумя белками. Действительно, бактериальный двухгибридный анализ подтвердил прямое взаимодействие между Slr7083 и HmpF _Syn (рис.). Взятые вместе, наше исследование идентифицировало две CCRP Synechocystis , которые участвуют в подвижности клеток и локализованы на периферии клетки, часто в виде серповидных структур.
Slr7083 и HmpF _Syn участвуют в подергивании моторики у Synechocystis .( A ) Объединенная флуоресценция GFP и аутофлуоресценция хлорофилла (красный) и микрофотографии в ярком поле клеток Synechocystis , экспрессирующих Slr7083-GFP, HmpF _Syn -YFP или PilB-GFP из P _cpc560 или P _cpc560) (Slr5070 trc (HmpF _Syn, PilB). Экспрессия PilB-GFP в PCC-M приводила к такому же паттерну локализации (данные не показаны). Белые треугольники обозначают очаги и образования в форме полумесяца. Масштабные линейки: 5 мкм. ( B ) Объединенные светлопольные микрофотографии и микрофотографии автофлуоресценции хлорофилла подвижных и неподвижных клеток Synechocystis WT, Δ slr7083 и Δ hmpF _Syn мутантных клеток.Ниже показаны тесты на подвижность трех отдельных колоний из указанных клеток, нанесенных штрихами на планшеты BG11 и освещенных только с одного направления. ( C ) Кривая роста мутантных штаммов Synechocystis WT, Δ slr7083 и Δ hmpF _Syn, выращенных вчетвером в стандартных условиях роста. Значения OD ₇₅₀ регистрировали один раз в день в течение 15 дней. Планки погрешностей показывают стандартное отклонение (n = 4). ( D ) Выдержка взаимодействующих белков, представляющих интерес, из масс-спектрометрического анализа коиммунопреципитации анти-GFP клеток Synechocystis , экспрессирующих HmpF _Syn -YFP из P _trc.( E ) Анализы бета-галактозидазы клеток E. coli , коэкспрессирующих указанные трансляционные слитые конструкции всех возможных парных комбинаций Slr7083 с HmpF _Syn, выращенных в течение 1 дня при 30 ° C. Количественные значения приведены в единицах Миллера на миллиграмм LacZ средних результатов для трех независимых колоний. Планки погрешностей указывают стандартные отклонения (n = 3). Neg: плазмида pKNT25, несущая hmpF _Syn, ко-трансформированная пустой pUT18C.Pos: Zip / Zip control. Значения, обозначенные *, значительно отличаются от отрицательного контроля. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, **** P <0,0001 (критерий множественного сравнения Даннета и однофакторный дисперсионный анализ).
All4981 представляет собой белок
Anabaena TPR, который формирует филаментоподобные структуры, возникающие из перегородки
Экспрессия All4981-GFP в Anabaena выявила многочисленные нитевидные структуры, которые пересекают клетку, в то время как в других клетках All4981-GFP был ассоциирован с перегородками клеток (рис.). Нитеподобные структуры All4981-GFP также иногда распространяются звездообразным образом в цитозоль. Кроме того, в свежеразорванных клетках, экспрессирующих All4981-GFP, нитевидные структуры ex vivo собраны в среде в взаимосвязанную сеть (дополнительный рис. ^4F), напоминающую паттерн полимеризации in vitro All4981 (рис. ). Мы подтвердили независимую от хозяина in vivo полимеризационную способность All4981 путем экспрессии All4981-GFP в Synechocystis , который не имеет гомологов с этим белком (рис.). Заинтригованные локализацией перегородки, мы проверили взаимодействие с SepJ, белком соединения перегородки в Anabaena ^⁷, и обнаружили слабое, хотя и значительное физическое взаимодействие (дополнительный рис. ^3A). Кроме того, бактериальные двухгибридные анализы показали, что All4981 сильно взаимодействует с определяющим форму клетки белком MreB (дополнительный фиг. ^3A). Примечательно, что ранее было показано, что MreB образует сходные нитевидные структуры в Anabaena .Однако, в отличие от генов в опероне mreBCD , избыточная экспрессия которых индуцирует аномальную морфологию клеток ^¹⁵, прямого морфогенного влияния не было обнаружено для All4981 в Anabaena . Вероятно, что All4981 является важным белком в Anabaena , поскольку мы не смогли создать штамм с делецией all4981 . Первоначально мы случайно также создали слитую конструкцию YFP-All4981 с делецией 240 п.н. между нуклеотидами 735 и 975 CDS all4981 , что привело к делеции третьего и четвертого TPR (YFP-All4981 ^ΔTPR3–4 ) оставив остальную ORF нетронутой.Примечательно, что этот слитый белок, подобно All4981-GFP, образовывал проходящие через клетки нитевидные или веретенообразные нити в Anabaena (Supplementary Fig. ^4G). Напротив, полноразмерный YFP-All4981 локализован в перегородках между двумя соседними клетками, но также обнаруживает нечеткую цитозольную локализацию (дополнительный рис. ^4G). Эксперименты по коиммунопреципитации после анализа ЖХ-МС / МС из Anabaena WT, экспрессирующего YFP-All4981 ^ΔTPR3–4, выявили ассоциацию YFP-All4981 ^ΔTPR3–4 с ParB, MinD и MreB (рис.). Таким образом, All4981 может участвовать в ParA / B / S-управляемой плазмиде или в сегрегации хромосом. Взаимодействие с MreB согласуется с локализацией in vivo YFP-All4981 ^ΔTPR3–4 в Anabaena (дополнительный рисунок ^4G) и результатами бактериального двухгибридного анализа (дополнительный рисунок ^3A). ). Дальнейшие взаимодействия были обнаружены с множеством предполагаемых белков S-слоя и prohibitin-подобных белков, а также с DevH, важным белком для синтеза гликолипидного слоя гетероцист.Примечательно, что мы никогда не наблюдали экспрессию All4981 в гетероцистах, независимо от флуоресцентной метки. All4981 также взаимодействовал с All4982, белком, кодируемым непосредственно перед all4981 , но не с All4983, который кодируется перед all4982 (дополнительный фиг. ^1C). Это наблюдение вместе с общим транскриптом all4981 и all4982 (дополнительная фиг. ^1C) предполагает общую функцию обоих белков. Таким образом, мы попытались локализовать All4982 с помощью тега eCFP в Anabaena , но не смогли наблюдать когерентный паттерн локализации.В целом, наши результаты демонстрируют, что All4981 связан с цитоскелетом MreB, перегородками и защитным S-слоем. Кроме того, All4981 полимеризует in vitro , in vivo и ex vivo , вероятно, необходим для Anabaena и, таким образом, классифицируется как новый цианобактериальный белок с TPR-повтором, способный полимеризоваться.
All4981 образует пронизывающие клетки нитевидные структуры у цианобактерий. ( A , B ) Флуоресценция GFP и объединенная флуоресценция GFP и аутофлуоресценция хлорофилла (красный) и микрофотографии в светлом поле ( A ) Anabaena и ( B ) Synechocystis -G, экспрессирующие клетки All4981-GFP. клеток Anabaena выращивали в BG11, _0, и клеток Synechocystis выращивали в BG11. ( A ) Проекции максимальной интенсивности Z-стека. Белые треугольники обозначают выбранные нитевидные нити, проходящие через ячейки. Белые стрелки указывают на веретенообразные структуры All4981-GFP. Белые звезды отмечают перегородочные образования между двумя соседними ячейками. Масштабные линейки: 5 мкм. ( C ) Выдержка взаимодействующих белков, представляющих интерес, из масс-спектрометрического анализа коиммунопреципитации против GFP клеток Anabaena , экспрессирующих YFP-All4981 ^ΔTPR3–4 из P _petE.
Synechococcus CCRP участвуют в цитокинезе и целостности колонии
Результаты in vivo локализации функционального слитого белка Syc2039-GFP (дополнительный рисунок ^{6E, F}) контрастировали с неоднозначной полимеризацией in vitro. узор (рис.). Нитевидные нити легко наблюдались у разных цианобактерий-хозяев, что указывает на то, что самополимеризация Syc2039 не зависит от хозяина (рис.). Однако Syc2039 образовывал разные структуры в каждом хосте.В Anabaena нитевидные структуры были длинными, изогнутыми и переплетенными; у Synechocystis Syc2039-GFP проявляется в виде веретенообразных структур, а у Synechococcus нитевидные структуры были длинными, иногда спиралевидными и часто выровнены или в непосредственной близости от оболочки клетки (рис.). Подобный спиральный или выровненный по периферии клетки паттерн локализации также наблюдался у E. coli (дополнительный фиг. ^1E). У Synechocystis и Synechococcus HmpF _Syc -GFP локализованы в виде пятен на периферии клетки, а у E.coli он, по-видимому, покрыл всю клеточную оболочку (рис., дополнительный рис. ^1E). HmpF _Syc -GFP не экспрессируется в Anabaena , что позволяет предположить, что (избыточная) экспрессия этого белка оказывает негативное влияние на этот организм. Используя замену двойного гомологичного гена, мы получили мутантный штамм Synechococcus ∆ syc2039 и несегрегированный штамм Synechococcus ∆ hmpF _Syc мутантный штамм (дополнительный рис.^{6A – C}). Несегрегированный характер мутанта ∆ hmpF _Syc предполагает, что этот ген выполняет важную клеточную функцию и не может быть полностью удален. Целостность колонии мутанта ∆ syc2039 не была изменена, в то время как мутант ∆ hmpF _Syc характеризовался явными изменениями морфологии колонии (рис.), Которые терялись при росте на неселективных чашках (дополнительный рис. ^6Д). Кроме того, оба мутанта показали нарушение роста жидкой культуры: мутант ∆ syc2039 рос в стандартной среде BG11, но не смог расти при добавлении нескольких осмотических стрессоров, тогда как мутант ∆ hmpF _Syc не смог расти в жидкая культура целиком (рис.). Точечные анализы подтвердили снижение жизнеспособности мутанта ∆ hmpF _Syc и показали, что он очень чувствителен к протеиназе K, но не подвержен влиянию лизоцима (дополнительный рисунок ^7A). Эти дефекты клеточной стенки вместе с образцом полимеризации in vitro клеточной формы позволяют предположить, что HmpF _Syc может формировать защитный и устойчивый к протеазам белковый слой под цитоплазматической мембраной. Эта возможность также согласуется с искаженной морфологией колонии несегрегированного мутантного штамма ∆ hmpF _Syc.На мутант Δ syc2039 не влияли дестабилизаторы клеточной стенки и мембраны (дополнительная фиг. ^7B). Чтобы исследовать роль этих белков в делении клеток, мы окрашивали внутриклеточную ДНК с помощью DAPI, и локализация FtsZ была обнаружена с помощью иммунофлуоресценции у Synechococcus WT и обоих мутантных штаммов. Часть мутантных клеток ∆ syc2039 демонстрирует сегрегированное распределение ДНК либо по обоим полюсам клетки, либо только по одному полюсу (рис.). Кроме того, некоторые клетки обоих мутантов лишены какой-либо заметной внутриклеточной ДНК или ощутимого сигнала хлорофилла и были удлинены по сравнению с WT (рис.). Фенотип WT мутанта ∆ syc2039 может быть спасен путем вставки P _trc :: syc2039 — gfp или P _syc2039 :: syc2039 в нейтральный локус NS1 ^{^{52 Дополнительный рисунок ^{6E, F}). Хотя обе мутантные клетки были удлиненными по сравнению с клетками WT (фиг.), Внутриклеточная локализация FtsZ не пострадала (дополнительная фиг. ^7C). И, несмотря на дефект цитокинеза, мутантный штамм Δ syc2039 показал такие же свойства роста жидкой культуры, как и WT (дополнительный рис.^7Д). Взятые вместе, Syc2039 образует многочисленные нитеподобные сети in vivo и участвует в цитокинезе или контроле клеточного цикла. Мы могли бы также показать, что hmpF _Syc является важным геном, важным для цитокинеза, клеточной целостности и образования колоний, участвующих в структурных функциях.}}
Synechococcus CCRPs влияют на цитокинез и клеточную целостность. ( A ) Объединенная флуоресценция GFP и аутофлуоресценция хлорофилла (красный) и микрофотографии в светлом поле клеток Synechocystis , Synechococcus и Anabaena , экспрессирующих Syc2039-GFP или HmpF _cpc-GFP2, Syc -GFP petE или P _trc. клеток Synechocystis выращивали в BG11, клеток Anabaena выращивали в BG11 ₀ с добавлением 0,25 мкМ CuSO ₄ в течение 1 дня, а клеток Synechococcus выращивали на чашках BG11 с добавлением 0,01 мМ (Syc2039) (Syc2039) (Syc2039). 1 мМ (HmpF _Syc) IPTG. Микрофотографии клеток Synechococcus и Anabaena , экспрессирующих Syc2039-GFP, представляют собой проекции максимальной интенсивности Z-стека. Белые треугольники обозначают пятна HmpF _Syc -GFP.Попытки трансляционно слить YFP-метку с N-концом Syc2039 были безуспешными, возможно, из-за трансмембранного домена, предсказанного для N-конца Syc2039 (дополнительная таблица ¹). ( B ) Образование колоний Synechococcus WT и мутантных штаммов на чашках BG11. ( C ) Жизнеспособность клеток Synechococcus WT и мутантных штаммов, выращенных в (I) BG11 или BG11 с добавлением (II) 5 мМ глюкозы, (III) 200 мМ глюкозы, (IV) 2 мМ NH ₄ Cl, (V) 200 мМ мальтозы или (VI) 500 мМ NaCl.( D ) Объединенные флуоресценция DAPI и автофлуоресценция хлорофилла (красный) и микрофотографии в светлом поле Synechococcus WT и мутантных штаммов, выращенных на чашках BG11 и окрашенных 10 мкг мл ^-1 DAPI. Белые треугольники указывают на неделящиеся клетки, демонстрирующие неоднородное расположение ДНК. ( E ) Длина клетки Synechococcus WT (n = 648), несегрегированных Δ hmpF _Syc (n = 417) и Δ syc2039 (n = 711) мутантных клеток.Значения, обозначенные *, значительно отличаются от WT. **** P <0,0001 (односторонний дисперсионный анализ с использованием теста множественных сравнений Турции). Масштабные линейки: 5 мкм.
Обсуждение
Более ранние исследования показали, что, вероятно, существует широкий спектр белков, богатых спиральной спиралью и содержащих стержневой домен, с IF-подобной функцией у прокариот ^²⁹. И действительно, сообщения о таких белках последовали за открытием Scy (в Streptomyces coelicolor ) и нескольких CCRP из Helicobacter pylori ^{³⁰, ³¹, ³⁴, ³⁵}.Здесь мы дополнительно исследовали присутствие и функцию CCRPs с филамент-образующими IF-подобными свойствами у прокариот, прогнозируя и оценивая CCPRs у цианобактерий. Наш анализ полимеризации in vitro позволил быстро обнаружить белки с потенциалом образования нитевидных структур in vitro с использованием флуоресцентной микроскопии. Тем не менее, мы отмечаем, что для окончательного доказательства нитей in vitro потребуется микроскопия с более высоким разрешением, такая как электронная микроскопия, и она будет рассмотрена в будущих исследованиях.Наблюдаемые длины белковых нитей находились в диапазоне ранее описанных in vitro нитей FtsZ ^⁵³ и человеческого прионного белка в его амилоидной форме ^⁵⁴, которые были получены аналогичной экспериментальной процедурой.
Наши результаты показывают, что Fm7001 собирается в полимеры in vitro при ренатурации из мочевины, а также in vivo , и что этот белок влияет на клеточную и трихомную морфологию, тем самым удовлетворяя основным критериям IF ^{⁴⁰, ⁵⁵}.Следовательно, мы предполагаем, что Fm7001 представляет собой новый формирующий нити CCRP, специфичный для многоклеточных, дифференцирующих клетки и ветвящихся цианобактерий. Плавающий полимерный лист Fm7001 в высокомолярной мочевине (например, 4,5 М мочевины) указывает на исключительно высокую способность Fm7001 к самоассоциации. Для сравнения, эукариотический белок IF Vimentin существует только в виде тетрамеров в 5 M мочевине ^²³. Эксперименты по локализации in vivo выявили важную роль С-конца Fm7001 для полимеризации, что является обычным наблюдением для известных прокариотических белков, образующих филамент, включая MreB ^⁵⁶, Кресцентин ^²⁵, а также эукариотические белки. ПФ белки ^{²³, ⁵⁷ — ⁶⁰}.Кроме того, приписываемое структурное сходство Fm7001 с ацетил-КоА-карбоксилазой может служить дополнительным подтверждением теории о том, что белки, образующие нити, происходят от метаболических ферментов, которые получили характеристики полимеризации ^⁶¹. Несмотря на это, метаболическая активность Fm7001 не оценивалась в нашем исследовании, поэтому его предполагаемая ферментативная активность еще предстоит проверить. Кроме того, до сих пор не существует достаточных систем модификации генома для Fischerella ^{⁶², ⁶³}, поскольку такой точный анализ функции Fm7001 в настоящее время невозможен.
Известно, что несколько прокариотических тубулиноподобных и актиноподобных белков цитоскелета, таких как ParM и TubZ, кодируются на плазмидах или бактериофагах ^{⁹, ⁶⁴}. В Synechocystis , slr7083 кодируется на большой плазмиде токсин-антитоксиновой защиты (pSYSA) ^⁶⁵, таким образом, он добавляет еще один белок в список тех CCRP, обладающих свойством собираться в филаментоподобные структуры, несущие автономно реплицирующийся генетический элемент.Предварительно мы подозревали, что Slr7083 играет роль в сегрегации плазмид, подобную ParM. Однако Slr7083 не обнаружил признаков динамических свойств, которые были бы необходимы для механизма сегрегации плазмиды. Поскольку Slr7083 был эктопически сверхэкспрессирован, это наблюдение следует воспринимать с недоверием, поскольку сверхэкспрессия может нарушить динамику белка. Более того, в отличие от ParM ^⁶⁶, Slr7083 не локализовался в веретенообразном паттерне in vivo и экспрессировался только на более поздних фазах роста, что противоречит возможному участию в клеточном цикле.Напротив, полимеры, образованные Slr7083 in vitro и in vivo , скорее предполагают, что он может образовывать белковый слой под цитоплазматической мембраной. Примечательно, что структуры Slr7083 in vitro напоминают ядерную пластинку, образованную ядерными ламинами и FilP, подобными шнурку , in vitro филаментов ^{²⁹, ⁶⁷, ⁶⁸}. Таким образом, можно предположить, что Slr7083 играет роль в клеточной жесткости, а также в жесткости и обеспечивает механическую стабилизацию клеток.Однако ограничение транскрипции только сравнительно коротким периодом фазы роста культуры ставит под сомнение идею о клеточно-стабилизирующей функции для Slr7083. Напротив, подвижность клеток у Synechocystis , по-видимому, частично регулируется с помощью Slr7083, напоминая о роли актинового цитоскелета у эукариот.
Роль Slr7083 в подвижности клеток, возможно, опосредуется посредством его взаимодействия с HmpF _Syn, который, как было ранее показано, важен для подергивания подвижности у Synechocystis ^⁵⁰.Пока неизвестно, как фоторецепторы передают воспринимаемые световые стимулы в аппарат моторики Synechocystis , что в конечном итоге приводит к фототактическим движениям ^⁶⁹. Можно предположить, что HmpF _Syn может составлять недостающее звено между двумя системами, возможно, в комбинации с Slr7083. Эта гипотеза подтверждается физическим взаимодействием HmpF _Syn с PilB и локализацией in vivo HmpF _Syn, которая аналогична наблюдаемой для PilB ^⁴⁹.Прямое взаимодействие HmpF _Syn и PilB обеспечивает дополнительную поддержку модели из Cho et al . ^⁵¹, согласно которому прямое взаимодействие HmpF с PilB могло активировать расширение пилуса системой типа IV. У N. punctiforme было обнаружено, что HmpF динамически локализуется на ведущем или отстающем полюсе гормогонии в зависимости от интенсивности света и зависимым образом от аппарата типа IV и системы Ptx ^⁵¹.В Synechocystis было показано, что локализация PilB коррелирует с направлением движения ^⁴⁹ и зависит от направления падающего света в комплексе с другим белком пилей ^⁷⁰. Учитывая его аналогичную локализацию с PilB, мы предполагаем, что подобно HmpF из N. punctiforme , HmpF _Syn может характеризоваться динамическими светозависимыми свойствами в комплексе с системой пилуса IV типа. Подобный комплекс подвижности наблюдался у Pseudomonas aeruginosa , где было показано, что FimL (предлагаемый каркасный белок со слабо предсказываемой спиральной спиралью) соединяет хемосенсорную рецепторную систему с устройством пилей типа IV, регулируя пути хемотаксии и вирулентности ^⁷¹.У эукариот клеточная подвижность сильно зависит от белков цитоскелета ^⁷², таким образом, возможно, что белки, образующие нити, также являются ключевыми факторами для передвижения клеток у прокариот. Хотя IFs не участвуют напрямую в подвижности клеток у эукариот ^⁷³, адаптация филамент-образующих CCRPs у прокариот для этой задачи возможна. Бактофилины представляют собой отдельный класс специфичных для прокариот полимеризующихся белков, и было предложено, чтобы они участвовали в координированной подвижности у C.crescentus ^⁴³. Кроме того, ранее было показано, что формирующий нити CCRP AglZ из Myxococcus xanthus регулирует подвижность скольжения вместе с мультибелковым комплексом, который также включает цитоскелет MreB ^{⁷⁴, ⁷⁵}. Примечательно, что взаимодействие HmpF _Syn с FtsZ и MinD, которые являются важными клеточными факторами, участвующими в делении клеток, цитокинезе и размещении Z-кольца ^⁷⁶, может указывать на то, что функция HmpF _Syn не ограничивается подвижностью.Хотя тилакоидные мембраны не создают физического барьера для собственных колебаний системы Min у Synechococcus , указывая на отсутствие прямого взаимодействия, MinD является частью тилакоидных фракций в Synechocystis ^⁷⁷. В связи с его локализацией в клеточной оболочке в Synechocystis , было бы интересно исследовать потенциальную связь между HmpF _Syn и развитием тилакоидов и цитокинезом во время клеточного деления. Несмотря на различные клеточные функции и свойства in vitro для полимеризации , гомологичные белки HmpF _Syn, HmpF _Syc и HmpF _Ana сохранили способность к перекрестному взаимодействию (дополнительный рис.^3А). Дальнейшие исследования могут быть сосредоточены на идентификации белковых доменов, которые опосредуют это взаимодействие, вероятно, находящихся в высококонсервативной области аминокислотной последовательности в этом семействе гомологичных белков (дополнительный рис. ^3B). Эти области, вероятно, важны для взаимодействия с видоспецифичными белками, которые приводят к их видоспецифичной клеточной функции.
TPR белки, как известно, опосредуют межбелковые взаимодействия и могут собираться в мультимеры, но их способность полимеризоваться в филаменты до сих пор не описана ^⁷⁸.Тем не менее, All4981 полимеризовал in vitro и образовал нитевидные структуры in vivo во всех тестируемых хозяевах. Кроме того, он образует внеклеточные филаментоподобные структуры и предположительно является важным белком в Anabaena . Эти наблюдения предполагают, что All4981 представляет собой bona fide прокариотический белок TPR со свойством филаментоподобной сборки. Ассоциация All4981 с MreB, FtsZ-регуляторами, S-слоем и SepJ указывает на то, что он может функционировать как мост, который соединяет детерминанты формы вне клеточной стенки и внутри цитоплазматической мембраны с участками межклеточных связей. (я.е. перегородочные соединения).
Принимая во внимание присутствие N-концевого трансмембранного домена и отсутствие четких филаментов in vitro, маловероятно, что Syc2039 представляет собой настоящий филамент-образующий белок. Тем не менее, большое количество нитевидных сетевых структур, сформированных во всех протестированных бактериальных хозяевах, позволяет предположить, что Syc2039 связан со структурами цитоскелета. В частности, удлиненный фенотип и нарушенный цитокинез у мутанта Synechococcus Δ syc2039 и несегрегированного мутанта Δ hmpF _Syc предполагают ассоциацию с FtsZ-управляемой дивизомой.Прямое взаимодействие с FtsZ или MreB невозможно показать, поэтому будущие исследования, вероятно, попытаются раскрыть предполагаемую связь CCRP Synechococcus с этими двумя основными системами цитоскелета. Примечательно, что помимо своего цитокинетического дефекта, мутант Δ syc2039 показал характеристики роста, подобные WT, что позволяет предположить, что механизмы обратной связи между цитокинезом и делением клеток нарушены у мутанта Δ syc2039 .
Наши результаты выявили два новых образующих нити CCRP — Fm7001 и All4981 — из разных субсекций и морфотипов цианобактерий (рис.). Таким образом, наше исследование расширяет спектр известных филамент-образующих CCRPs у прокариот и расширяет набор функциональных свойств, связанных с IF-подобными белками у прокариот. Как было предложено ранее ^²⁹, мы демонстрируем, что единственное наблюдение богатых спиральной спиралью областей в белковой последовательности не может рассматриваться как единственный предиктор полимеризации белка, следовательно, идентификация новых образующих нити белков требует дополнительных in vitro. и in vivo анализов.Цианобактериальные CCRP, о которых мы сообщаем здесь, как и другие бактериальные CCRP ^{²⁵, ²⁹, ³⁰, ³⁴, ³⁵, ⁷⁹} и эукариотические IFs ^⁸⁰ ), важны для определения формы клеток (Fm7001, HmpF _Syc и Syc2039), опосредуют клеточную подвижность (Slr7083 и HmpF _Syn), сегрегацию ДНК (HmpF _Syc и Syc2039) и целостность колонии (HmpF _Syc). .Таким образом, наше исследование укрепляет представление о том, что, подобно эукариотам, прокариотам требуются организованные внутренние комплексы и даже микрокомпартменты для поддержания формы, размера и правильного функционирования клеток, и подчеркивает полезность полимеризованных белковых структур для клеточных процессов. Примечательно, что некоторые из идентифицированных CCRP были высококонсервативными среди всех морфотипов цианобактерий, что позволяет предположить, что их функция законсервирована. Необходимы дальнейшие исследования для оценки функциональной консервации гомологичных белков у различных видов и морфотипов цианобактерий.С другой стороны, Syc2039 и Slr7083 очень специфичны к штамму, возможно, выполняя функцию, адаптированную к потребностям их хозяев. Подобно эукариотическим цитолинкерным белкам ^{⁸¹, ⁸²}, цианобактериальные CCRP часто были связаны с другими цитоскелетными системами (MreB, FtsZ и другие образующие волокна CCRP) и сайтами межклеточных связей (например, SepJ), что демонстрирует необходимость того, чтобы эти структуры находились в постоянном взаимодействии даже в сравнительно небольших ячейках.Открытие формирующих филамент CCRPs с разными уровнями консервации в различных морфотипах цианобактерий открывает новые возможности для исследования их вклада в морфологическое разнообразие цианобактерий.
Цианобактериальные системы CCRP. Схематические модели локализации in vivo цианобактериальных CCRPs в их соответствующих хозяевах. Fm7001 образует нитевидные струны в Fischerella . В Anabaena All4981 собирается в формирующиеся на полюсах филаментоподобные структуры, которые проходят через клетку или образуют локализованные в перегородке мостовидные образования.Syc2039, либо независимо от других белков Synechococcus , либо в прямом сотрудничестве с другими предполагаемыми нитевидными белками, образует длинные и иногда спиральные цепочки, которые часто выровнены или находятся в непосредственной близости от периферии клетки. У Synechococcus HmpF _Syc, вероятно, образует защитный белковый слой под цитоплазматической мембраной. В Synechocystis HmpF _Syn образует серповидные структуры, в то время как Slr7083, по-видимому, лежит в основе цитоплазматической мембраны.Оба типа локализации также наблюдались для PilB, что указывает на кооперативную функцию.
Материалы и методы
Данные и прогноз CCRP
Семейства цианобактериальных белков были сконструированы из полностью секвенированных геномов, доступных в базе данных RefSeq ^⁸³ (V. May 2016; Supplementary File ³). Для конструирования семейств белков на первом этапе все последовательности белков, аннотированные в геномах, были обработаны методом «все против всех» с использованием автономного BLAST ^⁸⁴ (V.2.2.26). Пары белковых последовательностей, которые были обнаружены как взаимно лучшие BLAST ^⁸⁵ совпадений (rBBHs) с порогом E-value ≤ 1 × 10 ⁻⁵, были дополнительно сравнены путем глобального выравнивания с использованием иглы ^⁸⁶ (пакет EMBOSS , V. 6.6.0.0). Пары последовательностей, содержащие ≥30% идентичных аминокислот, были сгруппированы в семейства белков с использованием алгоритма кластеризации Маркова (MCL) ^⁸⁷ (V. 12–135) с параметрами по умолчанию. Для предсказания CCRP были отброшены 1535 белковых последовательностей, содержащих нестандартные аминокислоты.Области спиральной спирали в белковых последовательностях были предсказаны с использованием PEPCOIL ^⁸⁶ (пакет EMBOSS, V. 6.6.0.0). Алгоритм был выполнен с размером окна 21, и порог для аминокислот в конформации спиральной спирали был установлен на ≥80 аминокислотных остатков, аналогично тому, как описано ранее ^²⁹. Статистические тесты проводились с помощью MatLab ©. Для сравнения доли CCRPs сравниваемые группы включали: (1) группу SynProCya, (2) одноклеточные цианобактерии, (3) одноклеточные цианобактерии, которые делятся более чем в одной плоскости, и (4) многоклеточные цианобактерии.Идентификацию консервативных аминокислотных доменов в гомологах CCRP цианобактерий (HmpF _Syn (Slr1301) и HmpF _Syc (Synpcc7942_1139)) проводили с использованием MULTALIGN ^⁸⁸.
Белки-кандидаты были дополнительно исследованы вручную с помощью доступных онлайн-биоинформатических инструментов (NCBI Conserved Domain (CD) Search ^⁸⁹, TMHMM Server ^⁹⁰ (V. 2.0), PSIPRED ^⁹¹, PSORTb ^⁹² (В.3.0), И-ТАССЕР ^⁹³. Были отобраны CCRP, предсказывающие аналогичные предсказания известных IF и IF-подобных белков, таких как CreS, FilP, виментин, десмин или кератин, и были исключены белки, которые, по прогнозам, участвуют в других клеточных процессах.
Штаммы бактерий и условия роста
Fischerella , Anabaena и Synechocystis были получены из Пастеровской коллекции культур цианобактерий (Франция). Synechococcus был подарком Мартина Хагеманна (Университет Ростока).Глюкозотолерантный подвижный состав Synechocystis Субштамм PCC-M был подарком Аннегрет Уайлд (Университет Фрайбурга). Клетки выращивали фотоавтотропно в BG11 или без комбинированного азота (BG11 ₀) в режиме свет / темнота 16 часов / 8 часов ( Fischerella ) или при постоянном освещении ( Anabaena , Synechococcus и Synechocystis ). интенсивность света 20 мкмоль м ⁻² с ⁻¹. При необходимости, 50 мкг / мл ^-1 канамицина (Km), 2.Добавляли 5 мкг мл ^-1 спектиномицина (Sp), 2,5 мкг мл ^-1 стрептомицина (Sm) или 30 мкг мл ^-1 неомицина (Нм). Несегрегированные Δ hmpF _Syc клетки всегда выращивали в присутствии Km. E. coli. штаммов DH5α, DH5αMCR, XL1-blue и HB101 использовали для клонирования и конъюгации путем трех родительского скрещивания. BTh201 использовали для анализов BACTH, а BL21 (DE3) использовали для экспрессии белков, меченных His и GFP, в E. coli .Все штаммы E. coli (дополнительная таблица ²) выращивали в среде LB, содержащей соответствующие антибиотики в стандартных концентрациях.
Конструирование плазмиды и штамма
Все плазмиды, использованные в этом исследовании, были либо получены с использованием стандартных процедур клонирования оснований рестрикционного фермента, либо с использованием сборки Гибсона ^⁹⁴. Подробное описание стратегий клонирования соответствующих плазмид доступно по запросу у авторов.Все праймеры, плазмиды и штаммы, использованные или созданные в этом исследовании, перечислены в дополнительных таблицах ² — ⁵. Белковые метки GFP, YFP и eCFP использовали в качестве репортерных белков, а метку His ₆ использовали для аффинной очистки белка. Для мутантов с заменой гена гомологичные фланки для двойной гомологичной рекомбинации составляли 1000 п.н. выше и ниже интересующего гена. Мутантные штаммы, несущие замены генов кассетами устойчивости к антибиотикам ( nptII ^⁹⁵ или CS.3 ^⁹⁶) были проверены с помощью ПЦР колоний на отсутствие интересующего гена с использованием праймеров № 129 / № 130 для Δ slr7083 , праймеров № 168 / № 169 для Δ hmpF _Syn, праймеры № 146 / № 147 для Δ syc2039 или праймеры № 161 / № 162 для Δ hmpF _Syc. Мы также попытались создать мутанты для замены генов для all4981 и fm7001 , но безуспешно.
Трансформация цианобактерий
Трансформация Synechococcus была достигнута естественной трансформацией, как описано ранее ^⁹⁷, а трансформация Synechocystis была осуществлена естественной трансформацией или конъюгацией, как описано ранее ^{⁹⁸, ^{⁹⁸ 902}. Anabaena и Fischerella были преобразованы конъюгацией, как описано ранее ^{⁶², ⁹⁹}. Бывшие конъюгированные колонии из Synechococcus и Synechocystis , несущих замены генов, повторно штриховали три-четыре раза, и отсутствие представляющих интерес генов проверяли с помощью ПЦР колоний. Трансформация обработанных ультразвуком (фрагментированных) и обработанных NaCl клеток Fischerella с последующим методом конъюгации ^⁹⁹ также возможна для Fischerella , хотя и с более низкой частотой трансформации.}
Фенотипическая характеристика мутантных штаммов
Дефекты жизнеспособности клеток оценивали с помощью точечных анализов, адаптированных из Dörrich et al . (2014) ^¹⁰⁰. Штаммы дикого типа и мутантные штаммы из жидких культур или планшетов с BG11 доводили до OD ₇₅₀ около 0,4 в жидкой жидкости BG11. Затем 5 мкл клеток наносили в трех экземплярах на планшеты BG11 или планшеты BG11 с добавлением протеиназы K или лизоцима в указанных концентрациях в 10-кратных серийных разведениях и инкубировали в стандартных условиях роста до тех пор, пока в наивысшем разведении не перестанут появляться новые колонии.
Дефекты роста оценивали с помощью кривых роста. Для этого клетки выращивали в жидкой среде BG11, трижды промывали центрифугированием (6500 × g , RT, 3 мин) в BG11, доводили до OD ₇₅₀ 0,1 и затем выращивали в трех или четырех экземплярах при стандартном росте. условия в 15 мл объемов культуры. Значения OD ₇₅₀ регистрировали каждые 24 часа.
Длину клеток Synechococcus WT, мутантных штаммов и мутантных штаммов комплементации измеряли с использованием линейного инструмента из программного обеспечения для визуализации Fiji и его подключаемого модуля microbeJ.
Дефекты целостности клеточной стенки оценивали путем тестирования влияния осмотических факторов на рост клеток. Synechococcus WT и мутантные штаммы выращивали на чашках с агаром BG11, переносили в жидкую среду BG11 и выращивали в стандартных условиях роста с 5 мМ глюкозы, 200 мМ глюкозы, 2 мМ NH ₄ Cl, 200 мМ мальтозы или 500 мМ или без них. NaCl.
Для оценки подвижности штаммов Synechocystis и PCC-M WT и мутантных штаммов три отдельные колонии соответствующего штамма наносили штрихами на линию на планшете для роста BG11.Затем планшеты для выращивания помещали в стандартный культуральный инкубатор на 10 дней с освещением, ограниченным с одного направления.
Очистка белка и
анализы филаментации in vitro
Для очистки белка клеток E. coli BL21 (DE3), несущих белки-кандидаты, помеченные His _6,, выращивали в ночных культурах при 37 ° C и 250 об / мин. На следующий день ночные культуры разводили 1:40 в той же среде и выращивали при 37 ° C до достижения OD ₆₀₀ 0.5–0,6. Экспрессию белка индуцировали 0,5 мМ IPTG в течение 3–4 ч при 37 ° C и 250 об / мин. После этого клеточные суспензии из аликвот по 50 мл собирали центрифугированием, один раз промывали PBS и хранили при -80 ° C до дальнейшего использования. Для анализов филаментации in vitro клеточные осадки ресуспендировали в буфере для лизиса мочевины (ULB: 50 мМ NaH ₂ PO ₄, 300 мМ NaCl, 25 мМ имидазол, 6 М мочевина; pH 8,0) и лизировали в Precellys. ® 24 (3 × 6500 об / мин в течение 30 с) с использованием набора для лизиса микроорганизмов 2 мл (VK01; Bertin) или самоупакованных пробирок Precellys с 0.Стеклянные бусины 1 мм. Полученный клеточный дебрис осаждали центрифугированием при 21000 × 90 169 g (30 мин, 4 ° C) и супернатант инкубировали с 1 мл Ni-NTA смолы HisPur ™ (Thermo Fischer Scientific) в течение 1 часа при 4 ° C в подвесной ротатор. Смолу промывали 5 раз 4-кратным объемом слоя смолы ULB и элюировали буфером для элюирования мочевины (UEB: ULB с добавлением 225 мМ имидазола). Концентрацию общего белка измеряли с помощью флуориметра Qubit® 3.0 (Thermo Fischer Scientific) и обычно доводили до 0.5–1,0 мг мл ^–1 перед диализом. Очищенные белки диализовали в течение ночи против буфера для полимеризации (PLB: 50 мМ PIPES, 100 мМ KCl, pH 7,0; HLB: 25 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, pH 7,4) при 18 ° C и 180 об / мин с тремя сменами ванны с использованием Slide- Устройство для диализа A-Lyzer ™ MINI (10 K MWCO, 0,5 мл или 2 мл; Thermo Fischer Scientific). Очищенные белки окрашивали 0,005 мг NHS-флуоресцеина (Thermo Fischer Scientific) на 1 мл диализата белка и филаментацию in vitro анализировали с помощью эпифлуоресцентной микроскопии.
Для Fm7001-His ₆ белки медленно диализовали против 2 мМ трис-HCl, 4,5 М мочевины, pH 7,5 (18 ° C, 200 об / мин), уменьшая 0,5 М мочевины каждые 2 ч (с 6 М до 4,5 М мочевины). ). Получающееся в результате плавающее полотно, напоминающее нити, было затем проанализировано с помощью микроскопии в светлом поле.
Syc2039-His ₆ не экспрессируется в E. coli BL21 (DE3). Чтобы обойти это, Syc2039-GFP-His под контролем IPTG-индуцибельного P _trc был вставлен в нейтральный локус Synechococcus .Клетки выращивали до OD ₇₅₀ 0,8 и экспрессию белка индуцировали 0,05 мМ IPTG в течение 3 дней. Индуцированные клетки собирали и промывали PBS центрифугированием (4800 × g, , 4 ° C, 10 мин) и хранили при -80 ° C. Затем проводили очистку, диализ и мечение белков, как описано выше, за исключением того, что в качестве диализата использовали среду для выращивания BG11.
Коиммунопреципитация
Для коиммунопреципитации флуоресцентно меченных кандидатов CCRP штаммы цианобактерий, экспрессирующие YFP-All4981 или HmpF _Syn -YFP, выращивали в жидкой среде BG11 или BG11 ₀.Около 20–30 мл соответствующей культуры осаждали центрифугированием (4800 × g , 10 мин, КТ), клетки дважды промывали центрифугированием (4800 × г , 10 мин, КТ) с 40 мл PBS, а затем ресуспендировали в 1 мл лизирующего буфера (PBS-N: PBS с добавлением 1% NP-40) с добавлением коктейля ингибиторов протеазы (PIC; cOmplete ^™, коктейль ингибиторов протеазы без EDTA, Sigma-Aldrich). Клетки лизировали с использованием набора для лизиса VK05 (Bertin) в гомогенизаторе Precellys® 24 (3 удара по 30 секунд при 6500 об / мин) и клеточный дебрис осаждали центрифугированием (30 мин, 21100 × g, , 4 ° C).К полученному бесклеточному супернатанту добавляли 50 мкл микрогранул μMACS anti-GFP MicroBeads (Miltenyi Biotec) и инкубировали в течение 1 ч при 4 ° C с умеренным вращением. После этого образец загружали в микроколонки (Miltenyl Biotec), дважды промывали 1 мл буфера для лизиса и элюировали 50 мкл буфера для элюции (50 мМ Tris HCl pH 6,8, 50 мМ DTT, 1% SDS, 1 мМ EDTA, 0,005% бромфеноловый синий, 10% глицерин; Miltenyl Biotec). До дальнейшего использования образцы хранили при -80 ° C. Белки идентифицировали масс-спектрометрией. Подробный протокол масс-спектрометрического анализа предоставляется по запросу у авторов.
Иммунофлуоресценция
Локализацию FtsZ в штаммах Synechococcus WT и мутантных штаммах оценивали с помощью иммунофлуоресценции с использованием модифицированного протокола из Heinz et al . ^¹⁰¹. Напротив, клетки лизировали в 50 мМ Tris-HCl pH 7,4, 10 мМ EDTA и 0,2 мг / мл лизоцима ^-1 в течение 30 минут при 37 ° C, и образцы блокировали в 1x Roti®-ImmunoBlock (Carl Roth) в PBS. с добавлением 0,05% твина 20. Образцы инкубировали с кроличьими первичными антителами против FtsZ (Agrisera; выращено против Anabaena, FtsZ; разведение 1: 250) в блокирующем буфере с последующей инкубацией с 7.5 мкг мл ^-1 Alexa Fluor 488-конъюгированных вторичных антител козы против кроличьего IgG (H + L) (Thermo Fischer Scientific) в блокирующем буфере. Перед микроскопией клетки окрашивали 10 мкг мл ^-1 DAPI (конечная концентрация) в PBS.
Анализ с помощью светового поля и флуоресцентной микроскопии
Бактериальные штаммы, выращенные в жидкой культуре, были либо непосредственно нанесены на предметное стекло микроскопа, либо предварительно иммобилизованы на 2% легкоплавкой агарозе в PBS агарозной подушке и высушены на воздухе перед микроскопическим анализом.Эпифлуоресцентную микроскопию выполняли с использованием светового микроскопа Axio Imager.M2 (Carl Zeiss), оснащенного объективом Plan-Apochromat 63 × / 1,40 Oil M27 и устройством визуализации AxioCam MR R3 (Carl Zeiss). Флуоресценцию GFP, Alexa Fluor 488, eCFP и YFP визуализировали с использованием набора фильтров 38 (Carl Zeiss; возбуждение: полосовой фильтр 470/40 нм; испускание: 525/50 нм BP). Автофлуоресценцию хлорофилла регистрировали с использованием набора фильтров 15 (Carl Zeiss; возбуждение: 546/12 нм BP; эмиссия: длинный проход 590 нм). Если применимо, клетки предварительно инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение примерно 5 мин с 10 мкг мл ^-1 DAPI в PBS для окрашивания внутриклеточной ДНК.Для визуализации флуоресцентных фильтров DAPI использовали набор 49 (Carl Zeiss; возбуждение: G 365 нм; испускание: 455/50 нм). Клетки E. coli BL21 (DE3), экспрессирующие на С-конце GFP-меченные белки-кандидаты, выращивали в течение ночи в LB, а затем разводили 1:40 в той же среде на следующий день. Клетки выращивали в течение 2 ч при 37 ° C, ненадолго акклиматизировали к 20 ° C в течение 10 мин и индуцировали 0,05 мМ IPTG при 20 ° C. Затем наблюдали локализацию белков, меченных GFP / YFP, через указанные временные точки для клеток, иммобилизованных на агарозной подушке.
Статистический анализ
Значения бета-галактозидазы измеряли в трех повторностях из трех независимых колоний, и значимые различия по сравнению с диким растением определяли односторонним дисперсионным анализом с использованием критерия множественного сравнения Даннета. Для статистической оценки Synechococcus WT и длины мутантных клеток использовали односторонний дисперсионный анализ с использованием теста множественного сравнения Турции. Уровни значимости такие же, как и для анализа с бета-галактозидазой. Статистические тесты проводились с GraphPad Prims 8.0.0 программное обеспечение. Уровни значимости обозначены звездочками (*) и соответствуют: * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, **** P <0,0001.
Выделение РНК
и ОТ-ПЦР
Тотальную РНК выделяли из 10 мл культуры с использованием набора Direct-zol ™ RNA MiniPrep (Zymo Research; Synechocystis , Synechococcus и Anabaena ) в соответствии с инструкциями производителя или реагент РНК растений (Thermo Fischer Scientific; Anabaena , Fischerella и Synechocystis ).Для выделения РНК с использованием реагента для растительной РНК использовали модифицированный протокол. Для этого клетки осаждали центрифугированием (4800 × g, , 10 мин, 4 ° C) и супернатант отбрасывали. Осадок ресуспендировали в 0,5 мл реагента растительной РНК и не подвергали лизису в гомогенизаторе Precellys® 24 (Bertin) с 3-мя ударами при 6500 об / мин в течение 30 с в пробирках для измельчения почвы (SK38) или жестких микроорганизмов (VK05) (Bertin). . Затем РНК выделяли в соответствии с инструкциями производителя. Выделенную РНК обрабатывали набором DNA-free ™ (2 единицы рДНК на реакцию; Thermo Fischer Scientific) и 1 мкг ( Fischerella , Synechocystis и Synechococcus ) или 200 нг ( Anabaena ) РНК подвергали обратной транскрипции с использованием мастер-смесь синтеза кДНК Maxima ™ H Minus (с dsDNase; Thermo Fischer Scientific, для Fischerella , Synechocystis и Synechococcus ) или набор для синтеза кДНК qScript ™ (Quanta Biosciences, для Anabaena ).ОТ-ПЦР образцов кДНК для fm7001 , ftsZ , slr7083 , rnpB , hmpF _Syn, syc2039 , hmpF 901 901 all4981 + all4982 и all4981 + all4983 был выполнен с использованием пар праймеров # 1 / # 2, # 3 / # 4, # 5 / # 6, # 7 / # 8, # 9 / # 10, # 11 / # 12, # 13 / # 14, # 15 / # 16, # 17 / # 15 и # 18 / # 15 соответственно.
Бактериальный двухгибридный анализ
В этом исследовании использовалась система BACTH (Euromedex).Гены-кандидаты клонировали в векторы экспрессии pKNT25, pKT25, pUT18 и pUT18C посредством сборки GIBSON, тем самым создавая C- и N-концевые трансляционные слияния с субъединицей T25 или T18. Химически компетентные клетки E. coli BTh201 (Δ cya ) котрансформировали 5 нг указанных плазмид, высевали на планшеты LB с добавлением 200 мкг мл ^-1 X-gal, 0,5 мМ IPTG, Amp, Км и выращивали при 30 ° C в течение 24–36 часов. Взаимодействия количественно оценивали с помощью анализов бета-галактозидазы из трех колоний для каждой комбинации в соответствии с протоколом, описанным Euromedex, или в 96-луночном формате ^¹⁰².Для этой цели культуры либо выращивали в течение ночи при 30 ° C, либо в течение 2 дней при 20 ° C в LB Amp, Km, 0,5 мМ IPTG, и сила взаимодействия исследуемых белков определялась количественно с помощью опосредованного бета-галактозидазой гидролиза ONPG. (орто-нитрофенил-β-галактозид), который затем записывается в единицах Миллера ^¹⁰³.
Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.
Настройка вашего браузера для приема файлов cookie
Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:
В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.
Почему этому сайту требуются файлы cookie?
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.
Что сохраняется в файле cookie?
Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.
Как правило, в cookie-файлах может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.
Идентификация и характеристика новых филамент-образующих белков у цианобактерий
% PDF-1.7 % 1 0 объект > / Метаданные 4 0 R / Страницы 2 0 R / StructTreeRoot 3 0 R / Тип / Каталог / Средство просмотра Предпочтения 5 0 R >> эндобдж 4 0 obj > поток application / pdf
Карина Штукен
Идентификация и характеристика новых филамент-образующих белков у цианобактерий
Microsoft Word2019-08-20T21: 18: 40Z2021-10-29T02: 01: 28-07: 002021-10-29T02: 01: 28-07: 00uuid: 7B3E35FC-9048-4285-9D95-5E0BF9A4AC53uuid: 7bc46a11-1dd2-11b2 -0a00-bf0000000000 конечный поток эндобдж 2 0 obj > эндобдж 3 0 obj > эндобдж 5 0 obj > эндобдж 240 0 объект > эндобдж 241 0 объект > эндобдж 243 0 объект [318 0 R 319 0 R 320 0 R 320 0 R 320 0 R 320 0 R 320 0 R 320 0 R 320 0 R 320 0 R 320 0 R 320 0 R 321 0 R 321 0 R 322 0 R 322 0 R 323 0 323 справа 0 324 0 325 0 326 0 327 0 328 0 329 0 330 0 R] эндобдж 244 0 объект [331 0 R 332 0 R 333 0 R 334 0 R] эндобдж 245 0 объект [335 0 R 335 0 335 0 R 336 0 R 337 0 R] эндобдж 246 0 объект [338 0 R] эндобдж 247 0 объект [339 0 R 340 0 R 341 0 R 342 0 R] эндобдж 248 0 объект [343 0 R 344 0 R 345 0 R] эндобдж 249 0 объект [346 0 R 347 0 R] эндобдж 250 0 объект [348 0 R 349 0 R] эндобдж 251 0 объект [350 0 R] эндобдж 252 0 объект [351 0 R 352 0 R 353 0 R 354 0 R] эндобдж 253 0 объект [355 0 R 356 0 R 357 0 R] эндобдж 254 0 объект [358 0 R 359 0 R 360 0 R] эндобдж 255 0 объект [361 0 R] эндобдж 256 0 объект [362 0 R 363 0 R 364 0 R] эндобдж 257 0 объект [365 0 R] эндобдж 258 0 объект [366 0 R 367 0 R 367 0 R 367 0 R 367 0 R 367 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R] эндобдж 259 0 объект [369 0 R 370 0 R 371 0 R] эндобдж 260 0 объект [372 0 R] эндобдж 261 0 объект [373 0 R 374 0 R 375 0 R 376 0 R] эндобдж 262 0 объект [377 0 R] эндобдж 263 0 объект [378 0 R 379 0 R 380 0 R 380 0 R 380 0 R 380 0 R 380 0 R 380 0 R 380 0 R 380 0 R 380 0 R 380 0 R 380 0 R 380 0 R 380 0 R 380 0 R 380 0 R 380 0 R 380 0 R 380 0 R 380 0 R 380 0 R 380 0 R 380 0 R 380 0 R 380 0 R 380 0 R 380 0 R 380 0 R 380 0 R 381 0 R] эндобдж 264 0 объект [382 0 R 383 0 R 384 0 R 385 0 R 386 0 R] эндобдж 265 0 объект [387 0 R 388 0 R 389 0 R 390 0 R 391 0 R 392 0 R] эндобдж 266 0 объект [393 0 R 394 0 R 395 0 R 396 0 R 397 0 R 398 0 R 399 0 R] эндобдж 267 0 объект [400 0 R 401 0 R 402 0 R 403 0 R 404 0 R] эндобдж 268 0 объект [405 0 R 406 0 R 407 0 R 408 0 R] эндобдж 269 0 объект [409 0 R 410 0 R 411 0 R 412 0 R] эндобдж 270 0 объект [413 0 R 414 0 R 415 0 R 416 0 R 417 0 R 418 0 R] эндобдж 271 0 объект [419 0 R 420 0 R 421 0 R 422 0 R 423 0 R 424 0 R 425 0 R 426 0 R 427 0 R 428 0 R] эндобдж 272 0 объект [429 0 R 430 0 R 431 0 R 432 0 R 433 0 R 434 0 R 435 0 R 436 0 R 437 0 R 438 0 R] эндобдж 273 0 объект [439 0 R 440 0 R 441 0 R 442 0 R 443 0 R 444 0 R 445 0 R 446 0 R 447 0 R 448 0 R] эндобдж 274 0 объект [449 0 R 450 0 R 451 0 R 452 0 R 453 0 R 454 0 R 455 0 R 456 0 R 457 0 R] эндобдж 275 0 объект [458 0 R 459 0 R 460 0 R 461 0 R 462 0 R 463 0 R 464 0 R 465 0 R 466 0 R 467 0 R] эндобдж 276 0 объект [468 0 R 469 0 R 470 0 R 471 0 R 472 0 R 473 0 R 474 0 R 475 0 R] эндобдж 277 0 объект [476 0 R 477 0 R 478 0 R 479 0 R 480 0 R 481 0 R 482 0 R 483 0 R 484 0 R] эндобдж 278 0 объект [485 0 R 486 0 R 487 0 R 488 0 R 489 0 R 490 0 R 491 0 R 492 0 R 493 0 R] эндобдж 279 0 объект [494 0 R 495 0 R 496 0 R 497 0 R 498 0 R 499 0 R 500 0 R 501 0 R 502 0 R 503 0 R] эндобдж 280 0 объект [504 0 R 505 0 R 506 0 R 507 0 R 508 0 R 509 0 R 510 0 R 511 0 R 512 0 R] эндобдж 281 0 объект [513 0 R 514 0 R 515 0 R 516 0 R 517 0 R 518 0 R 519 0 R 520 0 R 521 0 R 522 0 R] эндобдж 282 0 объект [523 0 R 524 0 R 525 0 R 526 0 R 527 0 R 528 0 R 529 0 R 530 0 R 531 0 R] эндобдж 283 0 объект [532 0 R 533 0 R] эндобдж 284 0 объект [534 0 R 535 0 R 535 0 R 537 0 R 538 0 R 536 0 R] эндобдж 285 0 объект [539 0 R 539 0 R 541 0 R 542 0 R 540 0 R] эндобдж 286 0 объект [543 0 R 543 0 R 545 0 R 546 0 R 544 0 R] эндобдж 287 0 объект [547 0 547 р. 549 0 р. 550 0 548 р.] эндобдж 288 0 объект [551 0 R 551 0 R 553 0 R 554 0 R 552 0 R] эндобдж 289 0 объект [555 0 R 555 0 R 557 0 R 558 0 R 556 0 R] эндобдж 290 0 объект [559 0 R 559 0 R 561 0 R 562 0 R 560 0 R] эндобдж 291 0 объект [563 0 R 564 0 R 566 0 R 567 0 R 565 0 R] эндобдж 292 0 объект [568 0 570 0 571 0 569 0 рандов] эндобдж 293 0 объект [572 0 R] эндобдж 294 0 объект [573 0 R 575 0 R 576 0 R 574 0 R] эндобдж 295 0 объект [577 0 R 577 0 R 577 0 R 577 0 R 577 0 R 577 0 R 577 0 R 577 0 R 577 0 R 577 0 R 577 0 R] эндобдж 296 0 объект [578 0 R 580 0 R 581 0 R 579 0 R] эндобдж 297 0 объект [582 0 R 584 0 R 585 0 R 583 0 R] эндобдж 298 0 объект [586 0 R 588 0 R 589 0 R 587 0 R] эндобдж 299 0 объект [590 0 R 616 0 R 617 0 R 618 0 R 619 0 R 620 0 R 621 0 R 622 0 R 623 0 R 624 0 R 625 0 R 626 0 R 627 0 R 628 0 R 629 0 R 630 0 R 631 0 R 632 0 R 633 0 R 634 0 R 635 0 R 636 0 R 637 0 R 638 0 R 639 0 R 640 0 R 641 0 R 642 0 R 643 0 R 644 0 R 645 0 R 646 0 R 647 0 R 648 0 R 649 0 R 650 0 R 651 0 R 652 0 R 653 0 R 654 0 R 655 0 R 656 0 R 657 0 R 658 0 R 659 0 R 660 0 R 661 0 R 662 0 R 663 0 R 664 0 665 0 R 666 0 R 667 0 R 668 0 R 669 0 R 670 0 R 671 0 R 672 0 R 673 0 R 674 0 R 675 0 R 676 0 R 677 0 R 678 0 R 679 0 R 680 0 R 681 0 R 682 0 R 683 0 R 684 0 R 685 0 R 686 0 R 687 0 R 688 0 R 689 0 R 690 0 R 691 0 R 692 0 R 693 0 R 694 0 R 695 0 R 696 0 R 697 0 R 698 0 R 699 0 R 700 0 R 701 0 R 702 0 R 703 0 R 704 0 R 705 0 R 706 0 R 707 0 R 708 0 R 709 0 R 710 0 R 711 0 R 712 0 R 713 0 R 714 0 715 0 R 716 0 R 717 0 R 718 0 R 719 0 R 720 0 R 721 0 R 722 0 R 723 0 R 724 0 R 725 0 R 726 0 R 727 0 R 728 0 R 729 0 R 730 0 R] эндобдж 300 0 объект [592 0 R] эндобдж 301 0 объект [593 0 R 859 0 R 859 0 R 860 0 R 860 0 R 861 0 R 861 0 R 862 0 R 862 0 R 863 0 R 864 0 R 865 0 R 866 0 R 867 0 R 868 0 R 869 0 R 870 0 R 871 0 R 872 0 R 873 0 R 874 0 R 875 0 R 876 0 R 877 0 R 878 0 R 879 0 R 880 0 R 881 0 R 882 0 R 883 0 R 884 0 R 885 0 R 886 0 R 887 0 R 888 0 R 889 0 R 890 0 R 891 0 R 892 0 R 893 0 R 894 0 R 895 0 R 896 0 R 897 0 R 898 0 R 899 0 R 900 0 R 901 0 R 902 0 R 903 0 R 904 0 R 905 0 R 906 0 R 907 0 R 908 0 R 909 0 R 910 0 R 911 0 R 912 0 R 913 0 R 914 0 R 915 0 R 916 0 R 917 0 R 918 0 R 919 0 R 920 0 921 ранда 0 922 рэнда 0 923 рэнда 0 924 рэнда 0 926 рэнда 0 927 рэнда 0 928 рэнда 0 929 рэнда 0 930 рэнда 0 595 рэнд] эндобдж 302 0 объект [596 0 R 1023 0 R 1023 0 R 1024 0 R 1024 0 R 1025 0 R 1025 0 R 1026 0 R 1026 0 R 1027 0 R 1028 0 R 1029 0 R 1030 0 R 1031 0 R 1032 0 R 1033 0 R 1034 0 R 1035 0 R 1036 0 R 1037 0 R 1038 0 R 1039 0 R 1040 0 R 1041 0 R 1042 0 R 1043 0 R 1044 0 R 1045 0 R 1046 0 R 1047 0 R 1048 0 R 1049 0 R 1050 0 R 1051 0 R 1052 0 R 1053 0 R 1054 0 R 1055 0 R 1056 0 R 1057 0 R 1058 0 R 1059 0 R 1060 0 R 1061 0 R 1062 0 R 1063 0 R 1064 0 R 1065 0 R 1066 0 R 1067 0 R 1068 0 R 1069 0 R 1070 0 R 1071 0 R 1072 0 R 1073 0 R 1074 0 R 1075 0 R 1076 0 R 1077 0 R 1078 0 R 1079 0 R 1080 0 R 1081 0 R 1082 0 R 1083 0 R 1084 0 R 1085 0 R 1086 0 R 1087 0 R 1088 0 R 1089 0 R 1090 0 R 1091 0 R 1092 0 R 1093 0 R 1094 0 R 1095 0 R 1096 0 R 1097 0 R 1098 0 R 1099 0 R 1100 0 R 1101 0 R 1102 0 R 1103 0 R 1104 0 R 1105 0 R 1106 0 R 1107 0 R 1108 0 R 1109 0 R 1110 0 R 1111 0 R 1112 0 R 1113 0 R 1114 0 R 1115 0 R 1116 0 R 1117 0 1118 0 правая 1119 0 правая 1120 0 правая 1121 0 правая 1122 0 правая 1123 0 правая 1124 0 правая 1125 0 правая 1126 0 правая 1127 0 правая 1128 0 правая 1 129 0 R 1130 0 R 1131 0 R 1132 0 R 1133 0 R 1134 0 R 1135 0 R 1136 0 R 1137 0 R 1138 0 R 1139 0 R 1140 0 R 1141 0 R 1142 0 R] эндобдж 303 0 объект [1323 0 R 1324 0 R 1325 0 R 1326 0 R 1327 0 R 1328 0 R 1329 0 R 1330 0 R 1331 0 R 1332 0 R 1333 0 R 1334 0 R 1335 0 R 1336 0 R 1337 0 R 1338 0 R 1339 0 R 1340 0 R 1341 0 R 1342 0 R 1343 0 R 1344 0 R 1345 0 R 1346 0 R 1347 0 R 1348 0 R 1349 0 R 1350 0 R 1351 0 R 1352 0 R 1353 0 R 1354 0 R 1355 0 R 1356 0 R 1357 0 R 1358 0 R 1359 0 R 1360 0 R 1361 0 R 1362 0 R 1363 0 R 1364 0 R 1365 0 R 1366 0 R 1367 0 R 1368 0 R 1369 0 R 1370 0 R 1371 0 R 1372 0 1373 0 R 1374 0 R 1375 0 R 1376 0 R 1377 0 R 1378 0 R 1379 0 R 1380 0 R 1381 0 R 1382 0 R 1383 0 R 1384 0 R 1385 0 R 1386 0 R 1387 0 R 1388 0 R 1389 0 R 1390 0 R 1391 0 R 1392 0 R 1393 0 R 1394 0 R 1395 0 R 1396 0 R 1397 0 R 1398 0 R 1399 0 R 1400 0 R 1401 0 R 1402 0 R 1403 0 R 1404 0 R 1405 0 R 1406 0 R 1407 0 R 1408 0 R 1409 0 R 1410 0 R 1411 0 R 1412 0 R 1413 0 R 1414 0 R] эндобдж 304 0 объект [1528 0 R 1529 0 R 1530 0 R 1531 0 R 1532 0 R 1533 0 R 1534 0 R 1535 0 R 1536 0 R 1537 0 R 1538 0 R 1539 0 R 1540 0 R 1541 0 R 1542 0 R 1543 0 R 1544 0 R 1545 0 R 1546 0 R 1547 0 R 1548 0 R 1549 0 R 1550 0 R 1551 0 R 1552 0 R 1553 0 R 1554 0 R 1555 0 R 1556 0 R 1557 0 R 1558 0 R 1559 0 R 1560 0 R 1561 0 R 1562 0 R 1563 0 R 1564 0 R 1565 0 R 1566 0 R 1567 0 R 1568 0 R 1569 0 R 1570 0 R 1571 0 R 1572 0 R 1573 0 R 1574 0 R 1575 0 R 1576 0 R 1577 0 1578 0 R 1579 0 R 1580 0 R 1581 0 R 1582 0 R 1583 0 R 1584 0 R 1585 0 R 1586 0 R 1587 0 R 1588 0 R 1589 0 R 1590 0 R 1591 0 R 1592 0 R 1593 0 R 1594 0 R 1595 0 R 1596 0 R 1597 0 R 1598 0 R 1599 0 R 1600 0 R 1601 0 R 1602 0 R 1603 0 R 1604 0 R 1605 0 R 1606 0 R 1607 0 R] эндобдж 305 0 объект [1712 0 R 1713 0 R 1714 0 R 1715 0 R 1716 0 R 1717 0 R 1718 0 R 1719 0 R 1720 0 R 1721 0 R 1722 0 R 1723 0 R 1724 0 R 1725 0 R 1726 0 R 1727 0 R 1728 0 R 1729 0 R 1730 0 R 1731 0 R 1732 0 R 1733 0 R 1734 0 R 1735 0 R 1736 0 R 1737 0 R 1738 0 R 1739 0 R 1740 0 R 1741 0 R 1742 0 R 1743 0 R 1744 0 R 1745 0 R 1746 0 R 1747 0 R 1748 0 R 1749 0 R 1750 0 R 1751 0 R 1752 0 R 1753 0 R 1754 0 R 1755 0 R 1756 0 R 1757 0 R 1758 0 R 1759 0 R 1760 0 R 1761 0 1762 руб. 0 1763 руб. 0 руб. 1764 0 пр. 1765 0 руб. 1766 0 руб. 1767 0 руб. 1768 0 руб. 1769 0 руб. 1770 0 руб. 1771 0 пр. 1772 0 пр. 1773 0 руб. 0 R 1779 0 R 1780 0 R 1781 0 R 1782 0 R 1783 0 R 1784 0 R 1785 0 R 1786 0 R 1787 0 R 1788 0 R 1789 0 R 1790 0 R 1791 0 R 1792 0 R 1793 0 R 1794 0 R 1795 0 R 1796 0 R 1797 0 R 1798 0 R 1799 0 R 1800 0 R 1801 0 R 1802 0 R 1803 0 R] эндобдж 306 0 объект [1917 0 R 1918 0 R 1919 0 R 1920 0 R 1921 0 R 1922 0 R 1923 0 R 1924 0 R 1925 0 R 1926 0 R 1927 0 R 1928 0 R 1929 0 R 1930 0 R 1931 0 R 1932 0 R 1933 0 R 1934 0 R 1935 0 R 1936 0 R 1937 0 R 1938 0 R 1939 0 R 1940 0 R 1941 0 R 1942 0 R 1943 0 R 1944 0 R 1945 0 R 1946 0 R 1947 0 R 1948 0 R 1949 0 R 1950 0 R 1951 0 R 1952 0 R 1953 0 R 1954 0 R 1955 0 R 1956 0 R 1957 0 R 1958 0 R 1959 0 R 1960 0 R 1961 0 R 1962 0 R 1963 0 R 1964 0 R 1965 0 R 1966 0 R 1967 0 R 1968 0 R 1969 0 R 1970 0 R 1971 0 R 1972 0 R 1973 0 R 1974 0 R 1975 0 R 1976 0 R 1977 0 R 1978 0 R 1979 0 R 1980 0 R 1981 0 R 1982 0 R 1983 0 R 1984 0 R 1985 0 R 1986 0 R 1987 0 R 1988 0 R 1989 0 R 1990 0 R 1991 0 R 1992 0 R 1993 0 R 1994 0 R 1995 0 R 1996 0 R] эндобдж 307 0 объект [2094 0 R 2095 0 R 2096 0 R 2097 0 R 2098 0 R 2099 0 R 2100 0 R 2101 0 R 2102 0 R 2103 0 R 2104 0 R 2105 0 R 2106 0 R 2107 0 R 2108 0 R 2109 0 R 2110 0 R 2111 0 R 2112 0 R 2113 0 R 2114 0 R 2115 0 R 2116 0 R 2117 0 R 2118 0 R 2119 0 R 2120 0 R 2121 0 R 2122 0 R 2123 0 R 2124 0 R 2125 0 R 2126 0 R 2127 0 R 2128 0 R 2129 0 R 2130 0 R 2131 0 R 2132 0 R 2133 0 R 2134 0 R 2135 0 R 2136 0 R 2137 0 R 2138 0 R 2139 0 R 2140 0 R 2141 0 R 2142 0 R 2143 0 R 2144 0 R 2145 0 R 2146 0 R 2147 0 R 2148 0 R 2149 0 R 2150 0 R 2151 0 R 2152 0 R 2153 0 R 2154 0 R 2155 0 R 2156 0 R 2157 0 R] эндобдж 308 0 объект [2244 0 R 2245 0 R 2246 0 R 2247 0 R 2248 0 R 2249 0 R 2250 0 R 2251 0 R 2252 0 R 2253 0 R 2254 0 R 2255 0 R 2256 0 R 2257 0 R 2258 0 R 2259 0 R 2260 0 R 2261 0 R 2262 0 R 2263 0 R 2264 0 R 2265 0 R 2266 0 R 2267 0 R 2268 0 R 2269 0 R 2270 0 R 2271 0 R 2272 0 R 2273 0 R 2274 0 R 2275 0 R 2276 0 R 2277 0 R 2278 0 R 2279 0 R 2280 0 R 2281 0 R 2282 0 R 2283 0 R 2284 0 R 2285 0 R 2286 0 R 2287 0 R 2288 0 R 2289 0 R 2290 0 R 2291 0 R 2292 0 R 2293 0 R 2294 0 R 2295 0 R 2296 0 R 2297 0 R 2298 0 R 2299 0 R 2300 0 R 2301 0 R 2302 0 R 2303 0 R 2304 0 R 2305 0 R 2306 0 R 2307 0 R 2308 0 R 2309 0 R 2310 0 R 2311 0 R 2312 0 R 2313 0 R 2314 0 R 2315 0 R 2316 0 R 2317 0 R 2318 0 R 2319 0 R 2320 0 R 2321 0 R 2322 0 R 2323 0 R 2324 0 R 2325 0 R 2326 0 R 2327 0 R] эндобдж 309 0 объект [2435 0 R 2436 0 R 2437 0 R 2438 0 R 2439 0 R 2440 0 R 2441 0 R 2442 0 R 2443 0 R 2444 0 R 2445 0 R 2446 0 R 2447 0 R 2448 0 R 2449 0 R 2450 0 R 2451 0 R 2452 0 R 2453 0 R 2454 0 R 2455 0 R 2456 0 R 2457 0 R 2458 0 R 2459 0 R 2460 0 R 2461 0 R 2462 0 R 2463 0 R 2464 0 R 2465 0 R 2466 0 R 2467 0 R 2468 0 R 2469 0 R 2470 0 R 2471 0 R 2472 0 R 2473 0 R 2474 0 R 2475 0 R 2476 0 R 2477 0 R 2478 0 R 2479 0 R 2480 0 R 2481 0 R 2482 0 R 2483 0 R 2484 0 R 2485 0 R 2486 0 R 2487 0 R 2488 0 R 2489 0 R 2490 0 R 2491 0 R 2492 0 R 2493 0 R 2494 0 R 2495 0 R 2496 0 R 2497 0 R 2498 0 R 2499 0 R 2500 0 R 2501 0 R 2502 0 R 2503 0 R 2504 0 R 2505 0 R 2506 0 R 2507 0 R 2508 0 R 2509 0 R 2510 0 R 2511 0 R 2512 0 R 2513 0 R 2514 0 R 2515 0 R 2516 0 R 2517 0 R 2518 0 2519 рэнд 0 2520 рэнд 2521 0 2522 рэнд] эндобдж 310 0 объект [2632 0 R 2633 0 R 2634 0 R 2635 0 R 2636 0 R 2637 0 R 2638 0 R 2639 0 R 2640 0 R 2641 0 R 2642 0 R 2643 0 R 2644 0 R 2645 0 R 2646 0 R 2647 0 R 2648 0 R 2649 0 R 2650 0 R 2651 0 R 2652 0 R 2653 0 R 2654 0 R 2655 0 R 2656 0 R 2657 0 R 2658 0 R 2659 0 R 2660 0 R 2661 0 R 2662 0 R 2663 0 R 2664 0 R 2665 0 R 2666 0 R 2667 0 R 2668 0 R 2669 0 R 2670 0 R 2671 0 R 2672 0 R 2673 0 R 2674 0 R 2675 0 R 2676 0 R 2677 0 R 2678 0 R 2679 0 R 2680 0 R 2681 0 2682 р 2683 0 р 2684 0 р 2685 0 р 2686 0 р 2687 0 р 2688 0 р 2689 0 р 2690 0 р 2691 0 р 2692 0 р 2693 0 р 2694 0 р 2695 0 р 2696 0 р 2697 0 р 2698 0 R 2699 0 R 2700 0 R 2701 0 R 2702 0 R 2703 0 R 2704 0 R 2705 0 R 2706 0 R 2707 0 R 2708 0 R 2709 0 R 2710 0 R 2711 0 R] эндобдж 311 0 объект [2811 0 R 2812 0 R 2813 0 R 2814 0 R 2815 0 R 2816 0 R 2817 0 R 2818 0 R 2819 0 R 2820 0 R 2821 0 R 2822 0 R 2823 0 R 2824 0 R 2825 0 R 2826 0 R 2827 0 R 2828 0 R 2829 0 R 2830 0 R 2831 0 R 2832 0 R 2833 0 R 2834 0 R 2835 0 R 2836 0 R 2837 0 R 2838 0 R 2839 0 R 2840 0 R 2841 0 R 2842 0 R 2843 0 R 2844 0 R 2845 0 R 2846 0 R 2847 0 R 2848 0 R 2849 0 R 2850 0 R 2851 0 R 2852 0 R 2853 0 R 2854 0 R 2855 0 R 2856 0 R 2857 0 R 2858 0 R 2859 0 R 2860 0 2861 0 R 2862 0 R 2863 0 R 2864 0 R 2865 0 R 2866 0 R 2867 0 R 2868 0 R 2869 0 R 2870 0 R 2871 0 R 2872 0 R 2873 0 R 2874 0 R 2875 0 R 2876 0 R 2877 0 2878 рэндов 0 2879 рэндов 0 2880 рэндов 0 2881 рэндов 0 2882 рэндов 0 р] эндобдж 312 0 объект [2978 0 R 2979 0 R 2980 0 R 2981 0 R 2982 0 R 2983 0 R 2984 0 R 2985 0 R 2986 0 R 2987 0 R 2988 0 R 2989 0 R 2990 0 R 2991 0 R 2992 0 R 2993 0 R 2994 0 R 2995 0 R 2996 0 R 2997 0 R 2998 0 R 2999 0 R 3000 0 R 3001 0 R 3002 0 R 3003 0 R 3004 0 R 3005 0 R 3006 0 R 3007 0 R 3008 0 R 3009 0 R 3010 0 R 3011 0 R 3012 0 R 3013 0 R 3014 0 R 3015 0 R 3016 0 R 3017 0 R 3018 0 R 3019 0 R 3020 0 R 3021 0 R 3022 0 R 3023 0 R 3024 0 R 3025 0 R 3026 0 R 3027 0 R 3028 0 R 3029 0 R 3030 0 R 3031 0 R 3032 0 R 3033 0 R 3034 0 R 3035 0 R 3036 0 R 3037 0 R 3038 0 R 3039 0 R 3040 0 R 3041 0 R 3042 0 R 3043 0 R 3044 0 R 3045 0 R 3046 0 R 3047 0 R 3048 0 R 3049 0 R 3050 0 R 3051 0 R 3052 0 R 3053 0 R 3054 0 R 3055 0 R 3056 0 R 3057 0 R 3058 0 R 3059 0 R 3060 0 R 3061 0 R 3062 0 R 3063 0 R 3064 0 R 3065 0 R] эндобдж 313 0 объект [3174 0 R 3175 0 R 3176 0 R 3177 0 R 3178 0 R 3179 0 R 3180 0 R 3181 0 R 3182 0 R 3183 0 R 3184 0 R 3185 0 R 3186 0 R 3187 0 R 3188 0 R 3189 0 R 3190 0 R 3191 0 R 3192 0 R 3193 0 R 3194 0 R 3194 0 R 3195 0 R 3195 0 R 3196 0 R 3196 0 R 3197 0 R 3197 0 R 3198 0 R 3199 0 R 3200 0 R 3201 0 R 3202 0 R 3203 0 R 3204 0 R 3205 0 R 3206 0 R 3207 0 R 3208 0 R 3209 0 R 3210 0 R 3211 0 R 3212 0 R 3213 0 R 3214 0 R 3215 0 R 3216 0 R 3217 0 R 3218 0 R 3219 0 R 3220 0 R 3221 0 R 3222 0 R 3223 0 R 3224 0 R 3225 0 R 3226 0 R 3227 0 R 3228 0 R 3229 0 R 3230 0 R 3231 0 R 3232 0 R 3233 0 R 3234 0 R 3235 0 R 3236 0 R 3237 0 R 3238 0 R 3239 0 R 3240 0 R 3241 0 R 3242 0 R 3243 0 R 3244 0 R 3245 0 R 3246 0 R 3247 0 R 3248 0 R 3249 0 R 3250 0 R] эндобдж 314 0 объект [3352 0 R 3353 0 R 3354 0 R 3355 0 R 3356 0 R 3357 0 R 3358 0 R 3359 0 R 3360 0 R 3361 0 R 3362 0 R 3363 0 R 3364 0 R 3365 0 R 3366 0 R 3367 0 R 3368 0 R 3369 0 R 3370 0 R 3371 0 R 3372 0 R 3373 0 R 3374 0 R 3375 0 R 3376 0 R 3377 0 R 3378 0 R 3379 0 R 3380 0 R 3381 0 R 3382 0 R 3383 0 R 3384 0 R 3385 0 R 3386 0 R 3387 0 R 3388 0 R 3389 0 R 3390 0 R 3391 0 R 3392 0 R 3393 0 R 3394 0 R 3395 0 R 3396 0 R 3397 0 R 3398 0 R 3399 0 R 3400 0 R 3401 0 R 3402 0 R 3403 0 R 3404 0 R 3405 0 R 3406 0 R 3407 0 R 3408 0 R 3409 0 R 3410 0 R 3411 0 R 3412 0 R 3413 0 R 3414 0 R 3415 0 R 3416 0 R 3417 0 R 3418 0 R 3419 0 R 3420 0 R 3421 0 R 3422 0 R 3423 0 R 3424 0 R 3425 0 R 3426 0 R 3427 0 R 3428 0 R 3429 0 R 3430 0 R 3431 0 R 3432 0 R 3433 0 R 3434 0 R 3435 0 R 3436 0 R 3437 0 R 3438 0 R 3439 0 R 3440 0 R 3441 0 R 3442 0 R 3443 0 R 3444 0 R 3445 0 R 3446 0 R 3447 0 R] эндобдж 315 0 объект [3577 0 R 3578 0 R 3579 0 R 3580 0 R 3581 0 R 3582 0 R 3583 0 R 3584 0 R 3585 0 R 3586 0 R 3587 0 R 3588 0 R 3589 0 R 3590 0 R 3591 0 R 3592 0 R 3593 0 R 3594 0 R 3595 0 R 3596 0 R 3597 0 R 3598 0 R 3599 0 R 3600 0 R 3601 0 R 3602 0 R 3603 0 R 3604 0 R 3605 0 R 3606 0 R 3607 0 R 3608 0 R 3609 0 R 3610 0 R 3611 0 R 3612 0 R 3613 0 R 3614 0 R 3615 0 R 3616 0 R 3617 0 R 3618 0 R 3619 0 R 3620 0 R 3621 0 R 3622 0 R 3623 0 R 3624 0 R 3625 0 R 3626 0 R 3627 0 R 3628 0 R 3629 0 R 3630 0 R 3631 0 R 3632 0 R 3633 0 R 3634 0 R 3635 0 R 3636 0 R 3637 0 R 3638 0 R 3639 0 R 3640 0 R 3641 0 R 3642 0 R 3643 0 R 3644 0 R 3645 0 R 3646 0 R 3647 0 R 3648 0 R 3649 0 R 3650 0 R 3651 0 R 3652 0 R 3653 0 R 3654 0 R 3655 0 R 3656 0 R 3657 0 R 3658 0 R 3659 0 R 3660 0 R 3661 0 R 3662 0 R 3663 0 R 3664 0 R 3665 0 R 3666 0 R 3667 0 R 3668 0 R 3669 0 R 3670 0 R 3670 0 R 3671 0 R 3672 0 R 3673 0 R 3674 0 R 3675 0 3676 0 R 3677 0 R 3678 0 R 3679 0 R 3680 0 R 3681 0 R 3682 0 R 3683 0 R 3684 0 R 3685 0 R 3686 0 R 3687 0 R 3688 0 R 3689 0 R 3690 0 R 3691 0 R 3692 0 R 3693 0 R 3694 0 R 3695 0 R 3696 0 R 3697 0 R 3698 0 R 3699 0 R 3700 0 R 3701 0 R 3702 0 R 3703 0 3704 0 р.] эндобдж 316 0 объект [3862 0 R 3863 0 R 3864 0 R 3865 0 R 3866 0 R 3867 0 R 3868 0 R 3869 0 R 3870 0 R 3871 0 R 3872 0 R 3873 0 R 3874 0 R 3875 0 R 3876 0 R 3877 0 R 3878 0 R 3879 0 R 3880 0 R 3881 0 R 3882 0 R 3883 0 R 3884 0 R 3885 0 R 3886 0 R 3887 0 R 3888 0 R 3889 0 R 3890 0 R 3891 0 R 3892 0 R 3893 0 R 3894 0 R 3895 0 R 3896 0 R 3897 0 R 3898 0 R 3899 0 R 3900 0 R 3901 0 R 3902 0 R 3903 0 R 3904 0 R 3905 0 R 3906 0 R 3907 0 R 3908 0 R 3909 0 R 3910 0 R 3911 0 R 3912 0 R 3913 0 R 3914 0 R 3915 0 R 3916 0 R 3917 0 R 3918 0 R 3919 0 R 3920 0 R 3921 0 R 3922 0 R 3923 0 R 3924 0 R 3925 0 R 3926 0 R 3927 0 R 3928 0 R 3929 0 R 3930 0 R 3931 0 R 3932 0 R 3933 0 R 3934 0 R 3935 0 R 3936 0 R 3937 0 R 3938 0 R 3939 0 R 3940 0 R 3941 0 R 3942 0 R 3943 0 R 3944 0 R 3945 0 R 3946 0 R 3947 0 R 3948 0 R 3949 0 R 3950 0 R 3951 0 R 3952 0 R 3953 0 R 3954 0 R 3955 0 R 3956 0 R 3957 0 R 3958 0 R 3959 0 R 3960 0 R 3961 0 3962 0 R 3963 0 R 3964 0 R 3965 0 R 3966 0 R 3967 0 R 3968 0 R 3969 0 R 3970 0 R 3971 0 R 3972 0 R 3973 0 R] эндобдж 317 0 объект [4097 0 R 4098 0 R 4099 0 R 4100 0 R 4101 0 R 4102 0 R 4103 0 R 4104 0 R 4105 0 R 4106 0 R 4107 0 R 4108 0 R 4109 0 R 4110 0 R 4111 0 R 4112 0 R 4113 0 R 4114 0 R 4115 0 R 4116 0 R 4117 0 R 4118 0 R 4119 0 R 4120 0 R 4121 0 R 4122 0 R 4123 0 R 4124 0 R 4125 0 R 4126 0 R 4127 0 R 4128 0 R 4129 0 R 4130 0 R 4131 0 R 4132 0 R 4133 0 R 4134 0 R 4135 0 R 4136 0 R 613 0 R 614 0 R 4137 0 R 4138 0 R] эндобдж 4097 0 объект > эндобдж 4098 0 объект > эндобдж 4099 0 объект > эндобдж 4100 0 объект > эндобдж 4101 0 объект > эндобдж 4102 0 объект > эндобдж 4103 0 объект > эндобдж 4104 0 объект > эндобдж 4105 0 объект > эндобдж 4106 0 объект > эндобдж 4107 0 объект > эндобдж 4108 0 объект > эндобдж 4109 0 объект > эндобдж 4110 0 объект > эндобдж 4111 0 объект > эндобдж 4112 0 объект > эндобдж 4113 0 объект > эндобдж 4114 0 объект > эндобдж 4115 0 объект > эндобдж 4116 0 объект > эндобдж 4117 0 объект > эндобдж 4118 0 объект > эндобдж 4119 0 объект > эндобдж 4120 0 объект > эндобдж 4121 0 объект > эндобдж 4122 0 объект > эндобдж 4123 0 объект > эндобдж 4124 0 объект > эндобдж 4125 0 объект > эндобдж 4126 0 объект > эндобдж 4127 0 объект > эндобдж 4128 0 объект > эндобдж 4129 0 объект > эндобдж 4130 0 объект > эндобдж 4131 0 объект > эндобдж 4132 0 объект > эндобдж 4133 0 объект > эндобдж 4134 0 объект > эндобдж 4135 0 объект > эндобдж 4136 0 объект > эндобдж 613 0 объект > эндобдж 614 0 объект > эндобдж 4137 0 объект > эндобдж 4138 0 объект > эндобдж 4177 0 объект > эндобдж 80 0 объект > / MediaBox [0 0 595 842] / Parent 2 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / StructParents 74 / Tabs / S / Type / Page >> эндобдж 4179 0 объект [4183 0 R] эндобдж 4180 0 объект > поток H ܗ Ms6 $ XJxrov5 [{p 堏, iQC ~
3-й чемпионат мира WTF по тхэквондо среди кадетов
ФИН Феменино -29 кг.[10 соревнований]
1) Масуме Ранджбар (IRI)
2) Фасай Чакнок (THA)
3) Хабиба Ахмед (EGY)
3) Каримова Муниса (Узбекистан)
FIN Masculino -33 кг. [30 участников]
1) Луис Салазар (Мексика)
2) Деян Исон Арконадо (ESP)
3) Даниил Ким (Узбекистан)
3) У-Хёк Чон (KOR)
FLY Феменино -33 кг.[20 соревнований]
1) Ратип Намсри (THA)
2) Эйлин Гонгора (Мексика)
3) Рита Бакишева (КАЗ)
3) Шахд Эльхоссейни (EGY)
FLY Masculino -37 кг. [27 участников]
1) Юсеф Мансур (EGY)
2) Thawin Yaengkulchow (THA)
3) Рияд Ширалиев (AZE)
3) Амирбек Тураев (UZB)
БАНТАМ Феменино -37 кг.[20 соревнований]
1) Азра Кавус (TUR)
2) Арианна Эспида (PHI)
3) Тока Ахмед (EGY)
3) Алиса Герасименко (UKR)
BANTAM Masculino -41 кг. [26 участников]
1) Абилхасан Бахытжан (КАЗ)
2) Шамиль Магомедов (Россия)
3) Милад Хайдари (DEN)
3) Рафаэль Коудси (LBN)
ПЕРО Феменино -41 кг.[20 участников]
1) Чу Джонгколраттанаваттана (THA)
2) Мобина Каливанд (IRI)
3) Эль-Глид Карима (TUN)
3) Карина Кливак (UKR)
ПЕРО Masculino -45 кг. [29 участников]
1) Амирарсалан Ханзаде (ИРИ)
2) Адхам Хусин (EGY)
3) Абдулла Глум (ОАЭ)
3) Танакрит Йодрак (THA)
СВЕТЛЫЙ Феменино -44 Кг.[21 конкурс]
1) Мэри Анджелина Алькантара (PHI)
2) Оксана Смирнова (RUS)
3) Tugce Cankurt (TUR)
3) Chaima Toumi (TUN)
LIGHT Masculino -49 кг. [23 участника]
1) Эмилио Сендехас Альфаро (Мексика)
2) Шаян Ростами (ИРИ)
3) Йонг-Хюк Нам (KOR)
3) Напат Сритимонгкол (THA)
Gráficas del Mundial de Cadetes 2017
ВЕЛТЕР Феменино -47 кг.[21 конкурс]
1) Газаль Солтани (IRI)
2) Исил Зафер (TUR)
3) Умидахон Хасанова (Узбекистан)
3) Мария Клара Пачеко (BRA)
WELTER Masculino -53 кг. [26 участников]
1) Ханмагомед Рамазанов (RUS)
2) Махмут Куску (TUR)
3) Szymon Piatkowski (POL)
3) Seung-Hyun Jeon (KOR)
СВЕТЛЫЙ СРЕДНИЙ Феменино -51 кг.[22 участника]
1) Sasikarn Tongchan (THA)
2) Dilara Kartal (TUR)
3) Vlada Grodnia (RUS)
3) Jumana Asfar (JOR)
СВЕТЛЫЙ СРЕДНИЙ Masculino -57 кг. [20 участников]
1) Александр Джорджев (BUL)
2) Седиг Рахиминия (IRI)
3) Артем Бурденюк (RUS)
3) Паннаторн Талайвонг (THA)
СРЕДНИЙ Феменино -55 Кг.[23 участника]
1) Cheyenne Brito Rico (ESP)
2) America Comonfort (MEX)
3) Лариса Лончарич (SLO)
3) Назанин Тонекабони (IRI)
MIDDLE Masculino -61 кг. [16 участников]
1) Роберто Сумуано (Мексика)
2) Амир Реза Гасеми Халаши (ИРИ)
3) Махмуд Мурси (EGY)
3) Карим Эль Хусейни (LBN)
ЛЕГКИЙ ТЯЖЕЛЫЙ Феменино -59 кг.[18 соревнований]
1) Хурийе Нур Эргин (TUR)
2) Ялда Ранджбар (IRI)
3) Шрея Рани (IND)
3) Лилия Хузина (RUS)
ЛЕГКИЙ ТЯЖЕЛЫЙ Masculino -65 кг. [16 участников]
1) Мохаммед Альсовайк (KSA)
2) Андреа Риондино (ITA)
3) Валерий Танасюк (UKR)
3) Ахмет Джан Тимагур (TUR)
HEAVY Femenino +59 кг.[15 соревнований]
1) Анна Пеконкина (RUS)
2) Павилай Кобкуеркуль (THA)
3) Бенгусу Йылмаз (TUR)
3) Мэн-Цих Тиан (TPE)
HEAVY Masculino +65 кг. [16 участников]
1) Тэ-Хван Сон (KOR)
2) Георгий Боровиков (RUS)
3) Кристиан Златев (BUL)
3) Фахед Сбейхи (JOR)
Характеристики и результаты
Día 1: F-29, F-33, F-51, M-65 y M + 65
Día 2: F-41, F-47, M-33, M-37 y M-53
День 3: F-44, F-55, F-59, M-41 y M-45
Día 4: F-37, F + 59, M-49, M-57 y M-61
Результаты для оборудования
Феменино
1) Тайландия (THA) — 64 пунто (3, 2, 0)
2) Туркиа (TUR) — 61 пунто (2, 2, 2)
3) Иран (IRI) — 58 пунто (2, 2 , 1)
4) Россия (RUS) — 42 пунто (1, 1, 2)
5) Мексика (MEX) — 30 пунто (0, 2, 0)
6) Египет (EGY) — 30 пунто (0, 0, 3)
7) Украина (UKR) — 26 пунто (0, 0, 2)
8) Филиппины (PHI) 24 пунто (1, 1, 0)
9) Испания (ESP) — 23 пунто (1, 0, 0)
10) Marruecos (MAR) — 21 точка (0, 0, 0)
… Завершенные результаты
Masculino
1) Мексика (MEX) — 49 пунто (3, 0, 0)
2) Иран (IRI) — 48 пунто (1, 3, 0)
3) Россия (RUS) — 43 пунто (1, 2 , 1)
4) Египет (EGY) — 39 пунто (1, 1, 1)
5) Кориа-дель-Сур (KOR) — 29 пунто (1, 0, 3)
6) Тайландия (THA) — 29 пунто ( 0, 1, 3)
7) Turquía (TUR) — 28 пунктов (0, 1, 1)
8) Kazajistán (KAZ) — 27 пунктов (1, 0, 0)
9) Болгария (BUL) — 25 пунктов (1, 0, 1)
10) Саудовская Аравия (KSA) — 21 точка (1, 0, 0)
… Завершенные результаты
Галерия (Fotos WT)
Лаура Лопес Родригес, Exclusivo MasTKD.

Карина каримова в контакте 3 августа: Страница не найдена - МГПУ

О проекте. Человек и закон. Первый канал

ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ПЕРВОКУРСНИКОВ ПО ЗАСЕЛЕНИЮ В ОБЩЕЖИТИЯ! / Главные новости

Акции Twitter упали на 10%. Бизнесу соцсети угрожает новая политика Apple :: Новости :: РБК Инвестиции

«Царицыно» приглашает на «Ночь в музее» / Музей-заповедник «Царицыно»

Карина Цуркан показала «логово шпионки»

Провозглашение независимости Республики Узбекистан 31 августа 1991 г.

Карина Канеллакис

Незаконные Cre-зависимые хромосомные перестройки в сперматидах трансгенных мышей

Произошла ошибка при настройке вашего пользовательского файла cookie

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Что сохраняется в файле cookie?

Идентификация и характеристика новых филамент-образующих белков у цианобактерий

Abstract

Введение

Результаты

Белки, богатые спиральной спиралью, широко распространены в цианобактериях

Цианобактериальные CCRP собираются в различные филаментоподобные структуры

Предполагаемые белки, образующие нити, образуют подобные нити структуры

Fm7001 образует нитевидные структуры

Slr7083 и HmpF

All4981 представляет собой белок

Обсуждение

Материалы и методы

Данные и прогноз CCRP

Штаммы бактерий и условия роста

Конструирование плазмиды и штамма

Трансформация цианобактерий

Фенотипическая характеристика мутантных штаммов

Очистка белка и

Коиммунопреципитация

Иммунофлуоресценция

Анализ с помощью светового поля и флуоресцентной микроскопии

Статистический анализ

и ОТ-ПЦР

Бактериальный двухгибридный анализ

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Что сохраняется в файле cookie?

Идентификация и характеристика новых филамент-образующих белков у цианобактерий

3-й чемпионат мира WTF по тхэквондо среди кадетов

Характеристики и результаты

Результаты для оборудования

Феменино

Masculino

Галерия (Fotos WT)

Добавить комментарий Отменить ответ